2019 Fiscal Year Annual Research Report
コラーゲン分泌を調節するカルシウム制御ネットワークの解析
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18H02135
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
柴田 秀樹 名古屋大学, 生命農学研究科, 准教授 (30314470)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | カルシウム / コラーゲン / COPII小胞 / 分泌経路 / 小胞体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コラーゲンはヒトの乾燥重量の約25%を占める構造蛋白質である。ヒトは28のコラーゲンをもつが、全コラーゲン量の9割に相当するI型コラーゲンは3本鎖らせん構造を形成し、その長さは約300 nmに及ぶ。新生コラーゲン分子は小胞体内腔においてこのらせん構造を形成し小胞体からの蛋白質輸送を担うCOPIIによってゴルジ体へと搬出されることが示されているが、COPIIが形成する典型的な輸送小胞の直径は60～90 nmであり、それよりも長いコラーゲン分子の輸送の仕組みの詳細は不明である。本研究では、I型コラーゲンの小胞体からの効率的な搬出にカルシウム結合蛋白質ALG-2が必要であることに着目し、その作用機構の解明を目指している。
本年度は、ALG-2の結合蛋白質として小胞体ストレスおよびDNA傷害によって誘導されるCDIP1（cell death-inducing p53 target protein 1）を同定し、CDIP1がさらに小胞体蛋白質VAPAおよびVAPBと結合していること、そしてCDIP1の発現が誘導されている細胞では、ALG-2がVAPBとカルシウム依存的複合体を形成することを示し報告した。また、ALG-2が小胞体幕蛋白質SARAF（store-operated calcium entry-associated regulatory factor）と結合し、SARAFのユビキチン修飾を阻害することを示した。ALG-2はCOPII外被覆構成蛋白質Sec31Aと結合するが、Sec31Aのユビキチン修飾とコラーゲン輸送との関連が報告されている。今後、ALG-2によるユビキチン修飾の制御機構を相互作用蛋白質ごとに比較することで、カルシウムシグナルとユビキチン修飾の関連、およびコラーゲン輸送の分子機構解明の一助となることが期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
小胞体に局在するALG-2の相互作用蛋白質を新たに同定し報告した。CDIP1およびSARAFとの相互作用はそれぞれ小胞体ストレス時および小胞体のカルシウムイオン枯渇に伴うカルシウム流入時に起こることから、それらの細胞環境におけるコラーゲン輸送の解析へと展開する。また、ALG-2およびSec31Aに遺伝子改変型アスコルビン酸ペルオキシダーゼを融合させた蛋白質を恒常的に発現する細胞を樹立し、融合蛋白質に近接する蛋白質の特異的ビオチン標識に成功した。そして、ビオチン標識された蛋白質を質量分析により同定したところ、未報告の初期分泌経路の制御蛋白質候補が複数得られた。樹立したA549由来の細胞株はTGF-beta1を添加することでコラーゲン合成を促進することが可能なため、それらの解析にも役立てられる。このように本研究はおおむね順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
ALG-2およびSec31Aの近傍蛋白質候補について、それらの細胞内局在を観察し、ALG-2とSec31Aが局在する小胞体の輸送小胞出芽領域で共局在するかを検討する。さらに候補蛋白質の予測機能ドメインごとの欠損変異体を作製し、局在様式と局在の分子機構の解明を進める。また、初期分泌経路の種々の蛋白質との相互作用解析をすすめるとともに、その発現抑制と過剰発現がコラーゲン輸送に及ぼす影響を観察する。A549由来細胞株にTGF-beta1を処理し、コラーゲン合成誘導の有無の条件下で近接依存性ビオチン標識実験を行い、小胞体の輸送小胞出芽領域への動員に差が生じる蛋白質の同定を目指す。
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Research Products
(4 results)
