2018 Fiscal Year Annual Research Report
Estimation of saponin chemical structures in soyfoods by profile anbalysis
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18H02149
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
塚本 知玄 岩手大学, 農学部, 教授 (20312514)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 大豆 / 大豆加工食品 / サポニン / 化学構造 / プロファイル解析 / LC-PDA/MS/MS / 生合成 / 遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）各種配糖体のLC-PDA/MS/MS分析結果を詳細に解析し，化学構造とMS及びMS/MSフラグメントパターンに関する新たな規則性が発見できた（Woo等，向山等，山根等，Son等）。これにより，数種類の主要サポニンのMSとMS/MSを確認すれば大豆種子サポニン生合成遺伝子の組合せが分かる体制が整った（Takahashi 等，Takagi等，Yano等，Komagamine等）。
（２）韓国のEMS処理大豆から2系統，DDMPサポニンを合成できない新変異が見つかった（Jagadeesh等）。 また日本のEMS処理大豆909系統の種子サポニン組成を調べた結果，35系統（3.85%）がサポニン組成変異で，それらの遺伝的多型は７カテゴリーに分類された（Panneerselvam等）。プロファイル解析の結果，アグリコンC-3位結合糖鎖にGalを付加できないと考えられる新変異が1系統（EnT-3131）発見された（山根等）。
（３）日本・中国・韓国の大豆とツルマメコレクションを調べた結果，中国に自生するツルマメ（Glycine soja）3805系統から，新規なサポニン組成を示す変異が34系統発見された。これら変異系統で観察された未確認サポニンのプロファイル解析結果から，変異系統では通常の大豆サポニン生合成遺伝子とは別の遺伝子が発現し，新規サポニンが合成蓄積すると推定された（Takahashi等）。
（４）マメ科モデル植物ミヤコグサを発芽させ，根部と地上部のサポニン組成を調べた結果，根部で大豆サポニンの一部（DDMP-βg）が合成されることを確認した。この結果は，大豆サポニン生合成に関与するはずの未確認遺伝子（C-3位結合糖鎖のGlcUA転移酵素をコード）の探索にミヤコグサが利用できることを示している（未発表）。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
（１）韓国のEMS処理大豆の中から初めて，DDMPサポニンを合成できないにも関わらずグループAサポニンを蓄積する変異が見つかった。これまでグループAサポニンのアグリコン，ソヤサポゲノールA（SS-A），はDDMPサポニンの前駆体ソヤサポゲノールB（SS-B）を経て合成されると考えられていたが，この変異体の発見により，SS-BからSS-Aの合成（SS-BのC-21位炭素への酸素原子の導入）とSS-BからDDMPサポニンの合成（SS-BのC-22位水酸基へのDDMPの付加）は，基質SS-Bをめぐって拮抗する反応であることが明らかとなり，大豆サポニン生合成経路の一端が解明された。
（２）日本のEMS処理大豆の中からC3位結合糖鎖第2糖にGalを付加できない変異が初めて見いだされたことで，アグリコンC-3位結合糖鎖がGlcUAで止まったグループAとDDMPサポニンのMSとMS/MS情報が得られ，プロファイル解析用データベースの構築が大きく前進した。
（３）上記の2変異が見つかったことで，LC-PDA/MS/MS分析で数種類の主要サポニンのLC-PDA/MS/MS分析結果を確認すればサポニン生合成遺伝子の組合せが判別できる範囲が大幅に広がった。これにより，これまで同定が困難であった微量サポニンを含めて，LC-PDA/MS/MS分析情報のみでサポニン組成を判別できるケースが大幅に増えた。
（４）これまでの研究で，大豆加工食品中のサポニン組成解析を進める基盤が整った。
（５）大豆サポニン生合成遺伝子のいくつか（C-3位結合糖鎖第１等GlcUAの転移酵素をコードなど）が未だに見つかっていなため，C-3位結合糖鎖を持たないグループAとDDMPサポニンに関するデータベースが欠落している。この遺伝子の変異体探索を続け，プロファイル解析用データベースの完成を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）未確認大豆サポニン生合成遺伝子（C-3位結合糖鎖GlcUA転移酵素とC-22位結合糖鎖末端糖アセチル化酵素をコード）の同定につながる変異体の探索を継続する。これら変異体の発見により，特定のサポニンを蓄積する（新たな健康機能性を有する，あるいは，これまでとは味が異なるなど）新品種大豆の育成に貢献する。
（２）EMS処理大豆系統で発見されたアグリコンC-3位結合糖鎖にGalを導入できない変異体EnT-3131は，種子胚軸にサポニンAb-δ（C3-GlcUA;C22-Ara-acetylGlc-soyasapogenol A）とDDMP-δ（C3-GlcUA;C22-DDMP-soyasapogenol B）を蓄積すると予想される。これらのサポニンは普通大豆種子胚軸では全く検出されない。EnT-3131を増殖し，得られた種子からこれら新規サポニンを単離精製し，NMRやIR等の機器分析結果を加味して化学構造を決定し，プロファイル解析から推定される上記の化学構造と一致するかどうか確認する。
（３）EnT-3131は，一般的な大豆種子の子葉で検出される主要サポニンDDMP-βg（C3-Glc-Gal-GlcUA;C22-DDMP-soyasapogenol B）を合成できない。逆相カラムを用いたサポニン組成分析では，DDMP-βgのすぐ前にショルダー成分として，DDMP-βg と分子質量（組成式）が同じだがMSとMS/MSパターンは異なる成分が溶出する。これまでこのピーク成分を単離精製することができず，その化学構造は不明であったが，EnT-3131ではこのピークが単独で存在する。この成分の化学構造解析により，新たな大豆サポニン生合成経路（新たなC-3位結合糖鎖配列を有する大豆サポニン）の発見が期待される。
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