2019 Fiscal Year Annual Research Report

乳タンパク質ラクトフェリンの抗ウイルス・抗菌作用の構造基盤解明と活性増強

Research Project

Project/Area Number	18H02151
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	永田宏次東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (30280788)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	鈴木道生東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (10647655) 川上浩共立女子大学, 家政学部, 教授 (90458860)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ラクトフェリン / HCV外被タンパク質E2 / CD81 / NV外被タンパク質P domain / 相互作用解析 / 相互作用阻害 / 唾液凝集素タンパク質 / 虫歯菌表層タンパク質
Outline of Annual Research Achievements	・LFとウイルス外殻／受容体タンパク質の発現、精製、相互作用解析、複合体構造解析 HCV外被タンパク質E2について、大腸菌および原虫を宿主とする発現系を構築し、昨年度は大腸菌を宿主として発現させたE2を精製したが、LFにもHCV受容体であるCD81LEL（ここでLELはlarge extracellular loop）にも結合しなかったため、E2のコンストラクトを再設計し、発現・精製した。大腸菌で発現し精製した再設計HCV外被タンパク質E2について、LFとの相互作用をプルダウンアッセイにより検出できた。このコンストラクトは人工的な領域を含むので、E2とLFやCD81LELとの親和性が最大になるように配列最適化後、複合体の立体構造解析を行う。原虫細胞で発現を試みた糖鎖付加E2については発現を検出できていないので、引き続き、検討を進める。一方、NV外被タンパク質P domainについては、大腸菌を宿主とする発現系を改良し、精製P domainの収量が86倍に向上した。NV外被タンパク質P domainとヒトのノロウイルス受容体の部分構造であるフコースとの相互作用を阻害する食品成分の探索を行い、候補物質を見出した。今後、P domainとLFの相互作用解析および複合体の立体構造解析を進める。・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析についてはすでに昨年度に行い、プルダウンアッセイにより、LFとSRCRドメインとAVPドメインの、どのペア間にも相互作用解析を検出した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason ・LFとウイルス外殻／受容体タンパク質の発現、精製、相互作用解析、複合体構造解析 HCV外被タンパク質E2について、大腸菌（糖鎖付加なし）と原生動物（糖鎖付加あり）を宿主として発現を行った。昨年度、大腸菌で発現したE2はLFにもCD81LELにも親和性を示さなかったが、今年度、E2のCD81LEL推定結合部位（2領域）を人工的リンカーで繋いだコンストラクトを構築し、容易に発現・精製に成功した。このE2新コンストラクトはLFに対してもCD81LELに対しても相互作用が検出された。次年度、人工的リンカーの配列を最適化し、E2-LF複合体およびE2-CD81LEL複合体の立体構造解析を進める。一方、NV外被タンパク質P domainについては、発現・精製系の改良により、大量のP domainを安定して得ることができるようになり、P domainとfucoseの相互作用を阻害する食品成分の探索を行い、候補物質を見出した。今後LFとの相互作用解析および複合体の立体構造解析を進める。［（3）やや遅れている。］・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析昨年度の段階で、唾液凝集素タンパク質も虫歯菌表層タンパク質も、発現・精製に成功し、期待した通りの相互作用を検出した。今後、相互作用解析および複合体の立体構造解析を進める。［（2）おおむね順調に進展している。］
Strategy for Future Research Activity	・LFとウイルス外殻／受容体タンパク質の発現、精製、相互作用解析、複合体構造解析１．HCV外被タンパク質E2の人工的リンカーの配列を最適化し、LF-E2複合体およびE2-CD81LEL複合体の立体構造解析と２．LFとP domainとの相互作用解析や複合体構造解析を今後の研究の推進方策とし、１と２の結果を踏まえ、ウイルス感染予防に有効なLF断片・変異体・誘導体の設計、活性評価を行う。・唾液凝集素タンパク質・虫歯菌表層タンパク質の発現系作製、発現、精製、相互作用解析３．唾液凝集素タンパク質の虫歯菌表層タンパク質相互作用ドメイン単独の立体構造解析、４．唾液凝集素タンパク質と虫歯菌表層タンパク質の複合体の立体構造解析、５．LF-唾液凝集素タンパク質複合体およびLF-虫歯菌表層タンパク質複合体の立体構造解析を今後の研究の推進方策とし、３～５の結果を踏まえ、虫歯菌・その他の病原細菌の感染予防に有効なLF断片・変異体・誘導体の設計、活性評価を行う。