2018 Fiscal Year Annual Research Report
ウイロイド感染に対する基礎的自然免疫・防御反応と矮化・壊疽病徴発現機構の解析
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18H02201
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
佐野 輝男 弘前大学, 農学生命科学部, 教授 (30142699)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
葛西 厚史 弘前大学, 農学生命科学部, 研究機関研究員 (80633982)
中原 健二 北海道大学, 農学研究院, 講師 (90315606)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ウイロイド / ダイサー様リボヌクレアーゼ / 壊疽症状 / 活性酸素種（ROS) / スーパーオキシドジスムターゼ / マイクロRNA398 / マイクロRNA398a-3p / ジベレリンβ水酸化酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
A. RNAサイレンシングのキー因子ダイサー様リボヌクレアーゼDCL2 と4 をノックダウンしたトマト（品種；マネーメーカー）DCL2&4i-72E（以下72E系統）にジャガイモやせいもウイロイド（PSTVd）を感染させると激しい矮化・葉巻と全身壊疽を生じる。72E系統では自然免疫の指標となる活性酸素種（ROS）を消去する酵素スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）とSODに銅を運搬するシャペロンタンパク質CCS1の発現を負に制御するマイクロRNA（miR398、miR398a-3p）が活性化されていたので、宿主自然免疫による防御反応からウイロイド感染に特徴的な壊疽病徴の発現に至る分子機構を分析した。すなわち、PSTVdを感染させると、72E系統では対照区には見られない激しい黄化・壊疽が現れ、壊疽発症葉では、異常に高いROS発生とmiR398/398a-3pの発現がみられた。一方、細胞質局在性のSOD1（SlSOD1, 2）とCCS1（SlSOD4）、及び葉緑体局在性のSOD2（SlSOD3）の発現レベルは低下していた。
B．PSTVdの病原性ドメインから大量に生成するウイロイド特異的small RNA（以下PSTVd-sRNA-44M）が、それと相補性の高い配列を含むユビキチンリガーゼ遺伝子（UBR7）を転写後発現調節で抑制する可能性を検証した結果、PSTVd感染/発病トマト植物体中のUBR7の転写量は変化せず、仮説を支持する結果は得られなかった。
C．RNAiでジベレリン水酸化酵素（GibβH）遺伝子発現をノックダウンした形質転換トマト（以下GibβHi-762）にPSTVdを接種すると、GibβHi-762系統では対照区に見られない激しい矮化・葉巻症状がみられた。感染トマトから全RNAを調製し、次世代シークエンサーによるRNAseq解析を実施し、再現性の高い結果を得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
RNAサイレンシングのキー因子ダイサー様リボヌクレアーゼDCL2 と4 をノックダウンしたトマト72E系統にPSTVdを感染させた時に生じる激しい黄化・壊疽症状と活性酸素種（ROS）の発生、ストレス応答性のマイクロRNA398/398a-3pの発現量の分析、及びROSの消去酵素スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）遺伝子の発現量解析の結果、特に、PSTVd感染で壊疽が生じている葉では、葉緑体局在性のマイクロRNA398a-3pの発現レベルが異常に高くなり、その結果、葉緑体局在性のCu/Zn依存性SOD2（SlSOD3）の発現が低レベルに抑えられた状態になり、結果として宿主の自然免疫に基づく防御反応により発生するROSの消去機能が低下し、ウイロイド感染に特徴的な黄化・壊疽病徴が発現することを明らかにすることができた
また、RNAiでジベレリンβ水酸化酵素（GibβH）遺伝子発現をノックダウンした形質転換トマトGibβHi-762系統にPSTVdを感染させ、次世代シークエンサーによるRNAseq解析を実施し、再現性の高い高品質のデータを取得することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
RNAサイレンシングのキー因子ダイサー様リボヌクレアーゼDCL2 と4 をノックダウンしたトマト72E系統にPSTVd感染で生じる激しい全身性の壊疽症状の分析から、壊疽症状の発生機構を明らかにすることができた。壊疽症状はウイロイド感染で生じる最も典型的且つ重大な病徴であるので、次年度はウイロイド感受性のトマト品種Rutgersを用いて、栽培トマト品種で発生する壊疽症状もこれと同じ機構で発生しているのかどうかを確認する。具体的には、病原性の異なるPSTVd変異体を用いて黄化・壊疽病徴の強さとROS発生量、及びマイクロRNA398/398a-3pの発現量とSOD遺伝子発現レベルを分析する。栽培品種で壊疽が生じる機構とウイロイドの病原性の関係を明らかにすることができれば、今後、耐病性品種開発につながる有益な情報が得られるものと期待される。また、DCL2と4をゲノム編集技術で破壊した変異体トマトの作出を継続する。
一年目で取得したRNAiでジベレリン水酸化酵素（GibβH）遺伝子発現をノックダウンした形質転換トマトGibβHi-762系統から取得した次世代シークエンサーによるRNAseq解析データを基に、当初の計画通り、ウイロイド感染による植物ホルモン生合成系遺伝子発現ネットワークの変動と異常の全体像を明らかにし、特に重要な役割を果たすジベレリン生合成関連遺伝子群の定量的発現解析を行う予定である。
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