2018 Fiscal Year Annual Research Report

Studies on the synchronous-resting mechanisms of the marine diatoms

Research Project

Project/Area Number	18H02266
Research Institution	Kochi University
Principal Investigator	山口晴生高知大学, 教育研究部自然科学系農学部門, 准教授 (10432816)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	外丸裕司国立研究開発法人水産研究・教育機構, 瀬戸内海区水産研究所, 主任研究員 (10416042) 木村圭佐賀大学, 農学部, 講師 (30612676) 堀田純一山形大学, 大学院理工学研究科, 准教授 (80301919)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	珪藻 / 休眠 / ブルーム / 代謝
Outline of Annual Research Achievements	珪藻類は海洋における最も主要な生産者の一つである。その増殖に関わる生態戦略は徐々に解明されつつあるが，大量に増殖した珪藻個体群（ブルーム）が唐突に終焉へと到る機構は未だ解明されていない。そのような状況でブルームの終焉要因として注目されるのが「休眠（休眠期細胞への変化）」である。しかしながら，珪藻を自在に休眠移行させる室内実験系ならびに休眠の評価解析系が整備されておらず，休眠移行の際に細胞にもたらされる代謝変化と休眠移行の引き金的因子等については未だ解明されていない。小型の珪藻種に至ってはそのあまりの小ささゆえ，休眠細胞を見出した報告はなかった。そこで本課題では，厳密に環境条件を制御した室内培養実験によって，休眠していく微小珪藻細胞の形態・生理状態・代謝産物の変動を包括的に明らかにし，同藻の同調的な休眠移行がブルームの終焉に及ぼす影響を定量的に評価することを目的とする。本年度に得られた成果は以下に総括される。＜強力・同調的休眠誘導系の確立＞モデル微小珪藻キートセロス・テヌイシマス（学名Chaetoceros tenuissimus）を対象にした強力かつ同等的な休眠誘導系を確立することができた。複合的な環境ストレスにさらすことで多くの細胞群を2ヶ月以上にわたって室内で休眠させることに成功した。＜休眠細胞の諸性状の特徴づけ＞休眠状態へと移行する際，珪藻の細胞内の構造はダイナミックに変化することが明らかとなった。具体的には，細胞内のクロロフィル色素を大幅に縮小させ，油状物質を蓄積させるとともに細胞内小器官を発達させることがわかった。これらのことは，微小珪藻の長期にわたる生残戦略を細胞生理の観点から合理的に説明可能な重要知見と位置づけられる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究で目指すことは，微小珪藻の休眠移行機構を生理・生態面から解明し，その機構に基づいて沿岸域における珪藻の消長現象を構築することにある。本年度，実験対象となる珪藻個体群を休眠状態へと誘導することに成功し，実験基盤となる休眠誘導培養システムを確立できた。このシステムで得られた休眠細胞の形態性状・発現遺伝子群を特徴づけることで，休眠機構の解明を進めることができた。これらの詳細については以下の通りであり，一部の計画については，より高精度な実験を実施・検討する必要があるものの，当初想定されたボトルネックは解消されている。したがって，当初の計画がおおむね予定どおり進捗していると判断される。＜強力・同調的休眠誘導系の確立＞休眠誘導に関わることが予備的に判明した各種環境条件下でモデル珪藻株を培養した。休眠細胞の形成を顕微鏡・画像解析装置で調べ，強力かつ同調的に休眠を誘導する条件を調べようとした。現在までに，室内環境下で培養した供試珪藻に対して“複合的”に環境ストレスを与えた場合，細胞個体群を休眠状態へと移行できることが判明した。このシステムにより，約2ヶ月以上にわたって珪藻細胞を休眠状態のまま維持できることに成功し，研究の基盤技術を構築することができた。＜休眠細胞の諸性状の特徴づけ＞休眠状態にあるモデル珪藻細胞は，クロロフィル色素を縮小させており，活発に光合成できる状態にはない。その一方で，細胞内に多量の油滴を蓄積させるとともに，特定の細胞小器官を発達させていることがわかった。この生理性状の変動により，本来の栄養細胞では生存できない環境においても，長期に亘って生残できることが示唆された。また，通常の栄養細胞群ならびに休眠移行する前段階の細胞群における発現遺伝子群を網羅解析したところ，後者において特徴的な発現遺伝子群が認められた。
Strategy for Future Research Activity	ブルームを終焉へと導く「微小珪藻の休眠移行」を解明するため，当初の計画にしたがい，後述する小課題に取り組む。当初大きな課題に位置付けていた「珪藻の休眠移行の同調性解明」「休眠以降における細胞諸性状の高解像度解析」については，より重点的に取り組んでいくべきである。＜休眠誘導・休眠評価系の確立＞今回確立した休眠誘導系を用いて供試珪藻種の休眠同調性について調べる。ここでは，初年度に導入したフローサイトメーターを用いて，細胞一つ一つの休眠状態を定量的に評価し，細胞群全体としてどの程度の細胞が休眠状態に陥っているのかを評価していく。これにより，休眠同調性の評価を推進していく。また，微小珪藻複数種についても培養することで，当該系の休眠移行に対する有効性を評価する。なお，珪藻細胞の休眠移行試験を行うにあたり，休眠状態をリアルタイムで正確に評価することは重要な課題である。そこで，休眠時に特徴的な「細胞構成物」を定量化できる系を確立し，細胞群の休眠状態を評価できるようにする。これにより休眠細胞についての細胞構造を詳細に解析する。ここでは，超解像な蛍光観察技術などを駆使する＜休眠移行における細胞諸性状・代謝変動の解析＞モデル珪藻の休眠に関わる発現遺伝子群を網羅的に解析する。この解析を高精度に行うために，今後は，当該藻のゲノム情報を高解像度で取得する。これを基に休眠に関わる遺伝子発現を明らかにし，休眠移行を分子レベルで説明可能な仮説モデルを構築する。これらの課題が予定どおり進捗した段階で，沿岸底泥に含まれる微小珪藻の細胞を調べる。ここでは，底泥に含まれる多種多様な微細粒子群のなかから，休眠している微小珪藻細胞を効率よく分画できる手法を開発し，それを用いて得られる細胞群の諸性状を明らかにしていく予定である。