2018 Fiscal Year Annual Research Report
Live-cell imaging of nuclear dynamics in oocyte during follicle culture
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18H02357
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
山縣 一夫 近畿大学, 生物理工学部, 准教授 (10361312)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 体外卵胞培養 / 再構成卵胞 / クロマチン / ライブセルイメージング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
哺乳動物卵子は卵巣において顆粒膜細胞で包まれた卵胞という形で存在しており、刺激を受けると短期間で大きさは数百倍にまで成長する。その間、核内においてはグローバルな遺伝子転写の変動と核内クロマチン局在の変換、減数分裂の再開などが行われ、その後の受精や発生を保障する特殊なクロマチン状態が形成される。我々はこの変化を卵子の「核機能性獲得ダイナミクス」と定義して、最終的にはその機序や生物学的な意義を明らかにすることを学術的問いとし、本申請期間においてはそのための方法論として体外卵胞培養しながら生きたままそれを観察する系を確立することを目的としている。併せて、期間の後半には始原生殖細胞や多能性幹細胞から誘導した再構成卵胞卵子に関して同様の検討を行い、それを卵胞内卵子と比較することで、本方法論の有用性を証明する。昨年度は研究期間の初年度として、ライブセルイメージングのための種々の条件検討に注力した。具体的には、卵巣より採取した未成熟卵胞（二次卵胞）卵子に直接顕微操作によって蛍光プローブを安定的に導入する方法論の開発、卵巣表面にある卵胞を培養しながら長時間観察するための顕微鏡条件、さらに卵巣の体外培養による卵胞の作出の条件検討を進めた。ここで確立された方法論は、卵胞や卵胞内卵子の観察に限らず、申請書が行っている受精直後や初期胚発生におけるクロマチン変換の観察にも応用され、別紙のとおりいくつかの成果に結びついた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本提案では、計画を大きく3つのステップに分け、１）未成熟卵胞内卵子への蛍光プローブ導入法の確立、２）イメージング後に産仔獲得が可能な体外卵胞培養法の確立、３）クロマチン動態の数値化と産仔作出能の関連付け、の順に研究を進めていくこととした。上述の通り、昨年度はライブセルイメージングのための条件検討を行い、結果的に卵胞内卵子に再現性良く蛍光プローブを導入するマイクロインジェクション法を確立した。また、卵胞や、さらには卵巣という顕微鏡観察をするには比較昨大きな組織を観察するため、培養皿の改良やレンズの選定を行った。これらの結果はおよそ当初の目標通りか、若干それ以上の進捗をしているしていると考えられるため、「おおむね順調に進展している」とした。合わせて、昨年度得られた各種条件などの情報は、申請者の他プロジェクトにも応用され相乗効果を生んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初申請書通り、本年度は上記ステップのうち、１）に関連して卵胞内卵子における細胞核の観察系の検討を引き続き行いつつ、合わせて２）の、イメージング後に産仔獲得が可能な体外卵胞培養法の確立を主たる目標において研究を進める。以下に具体的な推進方策を記述する。
１）卵胞内卵子における細胞核の観察系の検討。顆粒膜細胞に囲まれた卵胞内卵子は光透過性が低く、卵胞発育に伴って厚みも増す。さらに、その培養は厚みのあるプラスチックディッシュの上に載せたメッシュ上で行うため、必然的にレンズ先端から観察面までの距離が長くなる。このような制約の中で卵子細胞核を観察するために、一定の作動距離を保ちながらも明るく深部まで観察できるレンズを選定し、レーザー波長やパワーなどの撮影条件、さらにはデコンボリューションなどの画像解析条件を検討してゆく。
２）イメージング後に産仔獲得が可能な体外卵胞培養法の確立。我々はすでに体外で卵胞発育させながら長時間イメージングをする方法論を確立しつつある。しかし、残念ながら得られた卵子を受精させて産仔を得るどころか胚盤胞期までの培養にすら成功していない。そこで本年度は、得られた卵子から産仔を獲得することが可能な培養方法の確立を行う。具体的には、上述のメッシュ上での培養との組み合わせを検討する、光毒性をキャンセルする試薬を添加する、観察条件を検討する、などにより、長時間イメージングと高効率培養の両立を目指す。
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