2018 Fiscal Year Annual Research Report
膜外コンポーネントと共役して機能する新奇ABC輸送体の構造機能解析
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18H02386
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
村上 聡 東京工業大学, 生命理工学院, 教授 (30300966)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
成田 新一郎 盛岡大学, 栄養学部, 教授 (30338751)
徳田 元 盛岡大学, その他部局等, 学長 (40125943)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 構造生物学 / 膜輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
初年度は、構造解析の対象となる材料を大量に且つ高純度で得る事を初期目標とし、それを進めた。既に結晶構造が得られているアシネトバクター由来のマクロライド排出トランスポーターに加え、その他の生物種からも広く調査し、より良質の結晶を与えるホモログを得た。今後、輸送基質との共結晶構造解析を進める為の指針を得たと考えている。
加えて、マクロライド排出トランスポーターと構造的に類似性が多いにもかかわらず膜外コンポーネント（ペリプラズム蛋白および外膜蛋白）が全く異なり、機能も大きく異なるリポ蛋白質輸送系Lolシステムの結晶解析に向けた大量精製系の構築を、盛岡大グループと共同で行った。研究が進む大腸菌由来EcLolCDEにおいては全てのサブユニットを共発現させる系において結晶解析に十分な量を高純度で得る系の構築に成功した。高濃度において幾らか非特異的凝縮を起こす問題があるが、今後の条件検討により解決可能だと考えている。また、根粒細菌由来のLolシステムは、サブユニット構成が大腸菌と異なり膜貫通サブユニットが単一で大腸菌のLolCDEと比べ、分子構成が単純である。このMLolCDにつていも大量精製系の構築を進めている。培養条件などの検討を進めている。大腸菌由来LolCDE蛋白の非特異的凝集などの問題が解決できないなど、どうしようもない場合のバックアップとして十分研究対象となり得ることを観た。機能解析についても盛岡大グループとの共同で進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膜輸送体の機能の多様性について、マクロライド排出トランスポーターのほか、リポ蛋白質輸送体について研究を進めている。これらはATP加水分解エネルギーを動力とするABC輸送体であるが、膜外コンポーネントと共役して機能するプロトン共役型輸送体についても本年度は機能の本質に迫る動的な理解について進めることが出来た（elife(2018)）。また、ABC輸送体についてもATPの加水分解エネルギーだけでなく、膜を介したイオンの透過も起こることを電気化学的な手法で明らかにした（Sci. Adv.(2018)）。これら得られた知見や、用いられた実験手法を含む技法は、本課題で掲げる膜外コンポーネントと共役して機能するABC輸送体の構造機能解析の際にも適用するものであり、その確立においても大きな進歩があったといえる。
また、概要の項でも述べたが、研究対象蛋白質の高純度且つ大量調整系の構築は、本研究課題の基盤技術でありそれが初年度達成できたことはさしあたり順調であると評価できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
結晶化を行う。概要の項でも述べたが、大腸菌膜由来LolCDEは分散性に問題がある。これを如何に克服するかが2年目の課題となる。或いは、根粒菌由来蛋白質に乗り換えるかが前半の課題であり、判断である。マクロライド排出トランスポーターについては、良質結晶を与えるホモログで共結晶化を目指す。基質を含まない状態の結晶化も進めており、構造解析により、報告済みのアシネトバクター由来マクロライド排出トランスポーターとの構造比較により、機能解析に迫る構造情報が得られることを期待している。
さらに、LolCDEと共役する膜外コンポーネントにも研究対象を広げ、脂溶性基質の認識機構について構造解析と機能解析を盛岡大との共同により進める。
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