2018 Fiscal Year Annual Research Report

Mechanisms of growth arrest-induced primary cilium formation

Research Project

Project/Area Number	18H02398
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	水野健作東北大学, 生命科学研究科, 名誉教授 (70128396)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	一次繊毛 / 細胞増殖 / 微小管 / ユビキチンリガーゼ / 中心体
Outline of Annual Research Achievements	一次繊毛は細胞外からの多様なシグナルを受容するアンテナとして、細胞の増殖・分化の制御や組織の形成・維持に重要な役割を担っている。本研究では、増殖抑制シグナル依存的な一次繊毛の形成機構を解明するため、主に、血清飢餓刺激による母中心小体からのCP110/Cep97複合体の除去機構について解析し、本年度は以下の結果を得た。また、Cep97/CP110除去による軸糸微小管の伸長機構について、Cep97/CP110結合タンパク質であるCep104について解析し、以下の結果を得た。１）血清飢餓刺激によってCep97がユビキチンープロテアソーム系によって分解されることを見出した。また、ユビキチン化されないCep97変異体(3KR)は中心体に集積することを見出した。２）E3リガーゼの阻害剤を使った実験や、網羅的な発現抑制実験や、蛍光可視化免疫沈降アッセイ（VIPアッセイ）を用いたCep97との網羅的な結合実験により、Cep97のユビキチン化に関わるE3リガーゼとして、Cul3-KCTD10-Rbx1複合体を同定した。３）上記のE3リガーゼの構成タンパク質(Cul3, KCTD10, Rbx1)の発現抑制によって、Cep97の分解、Cep97/CP110の母中心小体からの除去、一次繊毛形成が抑制されることを見出し、Cul3-KCTD10-Rbx1複合体の一次繊毛形成における重要性を明らかにした(Nagai et al., JCS, 2018)。４）Cep104のTOGドメインが微小管重合活性を持つこと、Cep104のノックダウン／レスキュー実験により、Cep104の微小管重合活性が一次繊毛の伸長に必要であることを明らかにした。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本年度は、Cep97の分解、除去に関わるユビキチン化酵素を同定することを第１の目標とした。網羅的な解析によって候補を絞り込み、最終的にCep97のユビキチン化に関わるE3リガーゼとしてCul3-KCTD10-Rbx1複合体を同定することに成功した。この成果は、一次繊毛形成の分子機構を理解する上で重要な進展であり、おおむね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	１）Cep97/CP110の除去機構については、E3リガーゼとしてCul3-KCTD10-Rbx1複合体の同定に成功し、この酵素が母中心小体に局在していることを見出した。今後はこの局在化機構を解明することが重要である。また、この酵素は血清存在下でも中心体に局在していることから、この酵素の血清飢餓刺激による活性化機構を解明することが重要である。そのため、今後は、KCTD10の結合タンパク質を同定し、KCTD10の局在化機構と活性化機構を解明していく。２）Cep104による軸糸微小管伸長機構については、Cep104の微小管重合活性をCep97/CP110が抑制するかどうかを明らかにするとともに、Cep104と結合するNek1キナーゼの軸糸伸長における機能を解明していく。