2018 Fiscal Year Annual Research Report

PI(4)P依存的な小胞体-細胞膜接触部位による細胞運動制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	18H02400
Research Institution	Niigata University
Principal Investigator	中津史新潟大学, 医歯学系, 准教授 (50360607)
Project Period (FY)	2018-04-01 – 2021-03-31
Keywords	イノシトールリン脂質 / 細胞運動 / 小胞体ー細胞膜接触部位
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、イノシトールリン脂質phosphatidylinositol 4-phosphate（PI4P）に依存した小胞体―細胞膜接触部位の形成による細胞運動制御機構の解明を目的としている。方向性を持って運動している細胞の細胞膜イノシトールリン脂質分布をあらためて詳細に調べるために、抗体染色法による検出を試みた。抗体染色法によるイノシトールリン脂質の検出は、他の研究者により論文報告されているものの、条件設定が極めて困難であった。そこで、種々の培養条件、固定化条件などを検討し、野生型細胞で最終的に精度良くイノシトールリン脂質の検出が可能な条件を見いだした。これをもとに、運動性の高い細胞をイノシトールリン脂質種に対する抗体で染色したところ、特にPI4Pの分布の偏りを検出した。細胞膜におけるPI4Pは、typeIII phosphatidylinositol 4-kinaseにより合成されることが知られているため、特異的阻害剤を用いてその効果を検証したところ、特異的阻害剤の処理によって細胞膜の膜ラッフリングの消失および細胞運動の顕著な低下が観察された。これを今後さらに直接的に解析するために、ラパマイシンを用いたヘテロ２量体化法による急性的イノシトールリン脂質操作法を作成し、任意の場所において急性的にイノシトールリン脂質をリン酸化・脱リン酸化することで、運動している細胞のイノシトールリン脂質の分布の変化、および細胞運動の変化を詳細に解析する。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ほぼ計画通りに進行しているため。
Strategy for Future Research Activity	ラパマイシンを用いたヘテロ２量体化法などのケミカルバイオロジー手法や、光遺伝学的手法等により、細胞膜イノシトールリン脂質を急性的に合成・分解するツールの作成を行う。同時に、siRNAを用いたノックダウンやCIRSPR/Cas9によるノックアウト細胞を作成し、小胞体―細胞膜接触部位の形成をコントロールして細胞運動機能への影響を調べる。また、新たに同定した小胞体―細胞膜接触部位形成分子については、その局在の詳細な解析を染色法、ライブイメージング法により行う。