2018 Fiscal Year Annual Research Report
多角的アプローチによる繊毛内タンパク質輸送システムの解明
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18H02403
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
加藤 洋平 京都大学, 薬学研究科, 助教 (90568172)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 一次繊毛 / 繊毛病 / IFT複合体 / トランジションゾーン / 中心体 / モータータンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
一次繊毛は細胞のアンテナとして機能するオルガネラであり、その異常は多様な重篤症状を呈する繊毛病を引き起こす。一次繊毛の形成や機能維持において基盤となるのが繊毛内に受容体等を輸送する繊毛内タンパク質輸送（intraflagellar transport: IFT）システムである。IFTシステムを司るIFT装置は合計40種類以上のタンパク質から成る巨大で複雑な分子マシンである。
本年度はIFT装置のモータータンパク質であるヘテロ三量体キネシン2とダイニン2複合体に関する研究を行なった。IFT装置はヘテロ三量体キネシン2の働きによって繊毛基部から先端へ順行輸送され、ダイニン2複合体の働きによって繊毛先端から基部へと逆行輸送される。しかしIFT複合体とキネシン2と結合様式は不明であった。そこで私たちが開発した「観るだけでわかるタンパク質間相互作用解析法：visible immunoprecipitation (VIP)アッセイ」を駆使して相互作用解析を行い、キネシン2がIFT38、IFT52、IFT57、IFT88から成る四量体と結合することを発見した。さらにこの結合にはヘテロ三量体キネシン2のサブユニットであるKIF3BのC末端領域が重要であることを明らかにした。
IFT装置の逆行輸送を担うダイニン2複合体は11種類のサブユニット（重鎖DYNC2H1、中間軽鎖DYNC2LI1、中間鎖WDR34、WDR60、軽鎖DYNLL1/2、DYNLRB1/2、DYNLT1/3、TCTEX1D2）から構成されるが、複合体全体の構築様式や各サブユニットの機能は不明であった。本年度はVIPアッセイを用いてダイニン２複合体の構築様式を解明しただけでなく、WDR34とWDR60ノックアウト細胞の表現型解析を行うことで、これらのサブユニットが繊毛内逆行輸送に不可欠であることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヘテロ三量体キネシン2とIFT-B複合体との結合には、IFT38、IFT52、IFT57、IFT88の4つのサブユニットが必要であることを明らかにした(Funabashi et al. (2018) J. Cell Biol.)。さらに、11種類のサブユニット（重鎖DYNC2H1、中間軽鎖DYNC2LI1、中間鎖WDR34、WDR60、軽鎖DYNLL1/2、DYNLRB1/2、DYNLT1/3、TCTEX1D2）から成るダイニン2複合体の構築様式を解明しただけでなく、中間鎖のWDR34とWDR60の機能も解明し、2報の論文として発表した(Hamada et al. (2018) Mol. Biol. Cell; Tsurumi et al. (2019) Mol. Biol. Cell)。
以上のように研究成果を複数の論文として発表できたことから、本研究課題は概ね順調に進展していると評価している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はIFT輸送装置を構成するIFT-A複合体とIFT-B複合体の複合体間の相互作用に関与するサブユニットの同定と、IFT複合体とダイニン-2との相互作用に関与するサブユニットの同定を目指す。これらの相互作用解析には私たちの研究室で開発したタンパク質間相互作用解析法であるVIPアッセイを用いる。IFT複合体のサブユニット遺伝子やダイニン-2サブユニット遺伝子をCRISPR/Cas9システムを用いてノックアウト（KO）し、そのKO細胞の表現型を蛍光顕微鏡観察することで、繊毛形成および繊毛内タンパク質輸送に対する影響を明らかにする。さらにレンチウイルスベクターを用いて、KO細胞に野生型遺伝子や変異型遺伝子を発現させたレスキュー細胞を樹立し、それらの細胞の表現型を比較することでIFT輸送装置の機能の分子基盤を解明する。
また、繊毛のトランジションゾーン構成タンパク質や繊毛局在リン酸化酵素に関して、上記と同様に相互作用解析とKO細胞の表現型解析を行い、IFT輸送装置の制御機構を解明する。
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