2021 Fiscal Year Annual Research Report
Engineering of translation molecules for synthetic biology approach on the genetic code
| Project/Area Number |
18H02416
|
|---|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
坂本 健作 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (50240685)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 非天然アミノ酸 / メチルグルタミン / 拡張遺伝暗号 / 酵素変異体 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
共進化による新規tRNA・aaRSペアの創出に取り組んだ。これまでに、大腸菌GlnRSからは認識されないバリアントであるYtRNAを作製していた。このtRNAは大腸菌には存在しないaaRS分子種からは認識されることが示されており、大腸菌中で活性を示さないものの、立体構造的見地からは欠陥がないことが示されている。本年度は、YtRNAを認識してアミノ酸をチャージする活性と、非天然アミノ酸メチルグルタミンを認識する活性を１つのGlnRS変異体に実現するために、GlnRSにおける３つの領域に集中的にランダム変異を導入し、それらを組み合わせる方法をとった。１つはアンチコドン認識部位であり、２つめはアミノ酸結合部位である。グルタミンの側鎖アミノ基がメチル化されているので結晶構造中で近傍の5か所のアミノ酸残基をランダム変異させた。３つめの領域としては、tRNAのアクセプター・ステム近傍にあるアミノ酸残基を選んだ。本ステム末端には、アンチコドンと並んで重要なヌクレオチドが存在していると当時にアミノ酸結合部位にも近く、酵素側の変異によってYtRNAのアミノ酸結合活性が変化することを期待した。これらの領域の変異を組み合わせて徐々に活性を上げることができた。特徴的な変異として、アンチコドン認識ドメインとアミノ酸結合ドメインを繋ぐコネクティング・ペプチド(CN)内のアミノ酸置換（2か所）が活性を二倍程度改善することがわかった。ＣＮにおける変異は既に報告されているが今回の変異は新規である。最終的に、メチルグルタミンに対する特異性が十分ではなく、タンパク質への導入を検出する段階まで進むことができなかった。他方、YtRNAのように人工的に簡素化された構造を持ったtRNA分子に対してaaRSの認識がどのように改善するかについて新しい知見を得ることができた。
|
| Research Progress Status |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度が最終年度であるため、記入しない。
|
-
-
[Journal Article] An integrated computational pipeline for designing high-affinity nanobodies with expanded genetic codes2021
Author(s)
Aditya K Padhi, Ashutosh Kumar, Ken-ichi Haruna, Haruna Sato, Hiroko Tamura, Satoru Nagatoishi, Kouhei Tsumoto, Atushi Yamaguchi, Fumie Iraha, Mihoko Takahashi, Kensaku Sakamoto, Kam Y J Zhang
-
Journal Title
Briefings in Bioinformatics
Volume: 22
Pages: bbab338
DOI
Peer Reviewed
-
-
[Journal Article] Direct homophilic interaction of LAMP-2A with the two-domain architecture revealed by site-directed photo-crosslinks and steric hindrances in mammalian cells2021
Author(s)
Terasawa, K., Y. Kato, Y. Ikami, K. Sakamoto, K. Ohtake, S. Kusano, Y. Tomabechi, M. Kukimoto-Niino, M. Shirouzu, J. Guan, T. Kobayashi, T. Iwata, T. Watabe, S. Yokoyama, M. Hara-Yokoyama
-
Journal Title
Autophagy
Volume: 17
Pages: 4286-4304
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
