細胞内Hippoシグナルによる免疫システムの制御機構とその生理機能の解明

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02438
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 諸石 寿朗 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 准教授 (30647722)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Hippoシグナル / 免疫応答 / 免疫原性 / 自己免疫疾患

Outline of Annual Research Achievements

本年度の研究では、Hippo細胞内シグナルが免疫応答を制御する分子メカニズムを解明する目的で、RNAシーケンス解析により野生型とHippo経路を抑制した細胞の遺伝子発現を比較したところ、Hippo経路を抑制した細胞ではインターフェロン応答に関連する一連の遺伝子発現が上昇していることが明らかとなり、このことが宿主の免疫応答を誘導している可能性を見出した。また、これと並行して、Hippo経路の下流で免疫応答を制御する分子を全ゲノムを対象とした遺伝学的スクリーニングによって探索するためのレポーター細胞の作出も完了し、CRISPRシステムを用いた内在性遺伝子の過剰発現または遺伝子欠損による網羅的なスクリーニングが可能となった。さらに、Hippo経路による免疫応答制御の生物学的意義をマウス個体で解析するために、Hippo経路の構成因子の各種遺伝子改変マウスのコロニー立ち上げや、マウスに同種移植可能な正常線維芽細胞を用いてHippo経路を阻害した細胞の作出を行った。加えて、予備的な研究によりHippo経路を阻害する薬剤として同定していたいくつかの低分子化合物を、試験管内や細胞を用いた実験によってより詳細に評価し、効果と特異性の観点から特に有望な1つの化合物を選出した。これらの研究成果をふまえ、Hippo経路の新たな制御メカニズムや生物学的意義、免疫応答との相互作用に関して論文や学会での発表を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では細胞内Hippoシグナルによる免疫応答制御の動作原理と生理的意義の解明をめざし、「1. Hippo経路が免疫系を制御する分子メカニズムの解明」、「2. Hippo経路と免疫系の相互作用が織りなす生命現象の解明」、「3. Hippo経路を標的とした治療法の開発」に取り組んでいる。
1.に関しては、RNA-seq解析を用いてHippo経路を抑制した細胞と野生型の細胞の遺伝子発現を比較したところ、Hippo経路を抑制した細胞ではインターフェロン応答に関連する一連の遺伝子発現が上昇していることが明らかとなり、これが宿主の免疫応答を誘導している可能性を見出した。これと並行して、Hippo経路の下流で免疫応答を制御する分子を遺伝学的スクリーニングによって探索するためのレポーター細胞の作出も行った。作出したレポーター細胞は単一の細胞に由来し、テトラサイクリン誘導性にdCas9-VP64-p65-Rta (VPR)を発現し、導入したsgRNA配列に対応して特定の遺伝子の発現誘導を引き起こした。
2.に関しては、Hippo経路と免疫応答の関係をマウス個体で評価するため、Hippo経路を構成する様々な分子（MST1, MST2, LATS1, LATS2, YAP, およびTAZ）の遺伝子改変マウスのコロニーを立ち上げた。さらに、LATS1/2を欠損させHippo経路を阻害したBALB/cマウス由来の線維芽細胞も樹立し、Hippo経路を阻害した正常細胞をマウスに移植する系で免疫応答を評価することが可能となった。
3.に関しては、予備的な研究によりLATS1/2阻害剤として同定した３つの低分子化合物を試験管内や細胞を用いた実験によってより詳細に評価し、効果と特異性の観点から特に有望な1つの化合物を選出した。

Strategy for Future Research Activity

次年度は本年度より引き続き、細胞を用いた分子生物学・生化学的な実験からメカニズムの解明を試み、また、マウスを用いた実験も開始する。
1.に関しては、インターフェロン応答がHippo経路による炎症応答誘導の本質であるかを検証するため、得られた候補遺伝子がHippo経路によって直接転写を制御されるか検証する。また、並行したアプローチとして、本年度の研究で得られたレポーター細胞にsgRNAライブラリーを導入することにより、様々な遺伝子が過剰発現された変異細胞ライブラリーを作製し、Hippo経路の下流で免疫応答を誘導する分子を全ゲノムを対象とした遺伝学的スクリーニングによって探索する。
2.に関しては、引き続きHippo経路に関わる分子の遺伝子改変マウスの作出に取り組むとともに、本年度の研究で作出したHippo経路を阻害した線維芽細胞をBALB/cマウスに移植し、正常細胞における細胞内Hippoシグナルの改変が生体において免疫応答を誘導するかを検証する。
3.に関しては、本年度の研究によって選定したLATS1/2阻害化合物を用いてマウスがんモデルでの治療実験を進めるとともに、この化合物をポジコンとして、より効果的で特異性の高い薬剤のスクリーニングにも挑戦する。この目的のため、本年度は化合物ライブラリーのスクリーニングに必要なHippo経路のレポーター細胞の作出にも取り組む。

Research Products

• [Int'l Joint Research] University of California, San Diego/Salk Institute for Biological Studies(米国)
  • Country Name: U.S.A.
  • Counterpart Institution: University of California, San Diego/Salk Institute for Biological Studies
• [Journal Article] Hippo Pathway in Mammalian Adaptive Immune System (2019)
  • Author(s): Yamauchi, T., Moroishi, T.
  • Journal Title: Cells Volume: 8 Pages: 398～398
  • DOI: 10.3390/cells8050398
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] BRCA1/BARD1-dependent ubiquitination of NF2 regulates Hippo-YAP1 signaling (2019)
  • Author(s): Verma, S., Yeddula, N., Soda, Y., Zhu, Q., Pao, G.M., Moresco, J., Diedrich, J.K., Hong, A., Plouffe, S., Moroishi, T., Guan, K.L., and Verma, I.M.
  • Journal Title: Proceedings of the National Academy of Sciences Volume: 116 Pages: 7363～7370
  • DOI: 10.1073/pnas.1822155116
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Cell type-dependent function of LATS1/2 in cancer cell growth (2018)
  • Author(s): Pan, W.W., Moroishi, T., Koo,J.H., and Guan, K.L.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 38 Pages: 2595～2610
  • DOI: 10.1038/s41388-018-0610-8
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] RAP2 mediates mechanoresponses of the Hippo pathway (2018)
  • Author(s): Meng, Z., Qiu, Y., Lin, K.C., Kumar, A., Placone, J.K., Fang, C., Wang, K.C., Lu, S., Pan, M., Hong, A.W., Moroishi, T., Luo, M., Plouffe, S.W., Diao, Y., Ye, Z., Park, H.W., Wang, X., Yu, F.X., Chien, S., Wang, C.Y., Ren, B., Engler, A.J., and Guan, K.L.
  • Journal Title: Nature Volume: 560 Pages: 655～660
  • DOI: 10.1038/s41586-018-0444-0
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Assembly and activation of the Hippo signalome by FAT1 tumor suppressor (2018)
  • Author(s): Martin, D., Degese, M.S., Vitale-Cross, L., Iglesias-Bartolome, R., Valera, J.L.C., Wang, Z., Feng, X., Yeerna, H., Vadmal, V., Moroishi, T., Thorne, R.F., Zaida, M., Siegele, B., Cheong, S.C., Molinolo, A.A., Samuels, Y., Tamayo, P., Guan, K.L., Lippman, S.M., Lyons, J.G., and Gutkind, J.S.
  • Journal Title: Nature Communications Volume: 9 Pages: 2372
  • DOI: 10.1038/s41467-018-04590-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] Targeting the Hippo intracellular signaling pathway for cancer immunotherapy (2018)
  • Author(s): Moroishi, T.
  • Organizer: THE 45th NAITO CONFERENCE: Immunological and Molecular Bases for Cancer Immunotherapy
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Hippo経路と細胞外小胞によるがん免疫の制御 (2018)
  • Author(s): 諸石寿朗
  • Organizer: 第41回日本分子生物学会年会
• [Remarks] 熊本大学 大学院生命科学研究部 分子酵素化学講座
  • URL: https://www.moroishi-lab.com