モルフォゲンの分布とシグナル範囲を規定するヘパラン硫酸クラスターの解析

2019 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H02447
• Research Institution: Chuo University
• Principal Investigator: 平良 眞規 中央大学, 理工学部, 共同研究員 (60150083)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: へパラン硫酸 / へパラン硫酸修飾酵素 / N-acetylへパラン硫酸 / N-sulfoへパラン硫酸 / 単純ヘルペスウイルス・エンベロープタンパク質gD

Outline of Annual Research Achievements

本研究の目的の一つは、HSの特徴的な修飾パターンごとにクラスターが形成されることを明らかにすることである。そこで単純ヘルペスウイルスのエンベロープタンパク質gDを指標として検討した。gDは分泌タンパク質であるが、HAタグ付きgD-HAをXenopus胚に発現させ、原腸胚期で固定して抗HA抗体で免疫染色したが、細胞間隙には検出されなかった。そこで分泌の有無を確認するため以下の方法をとった。まず2重タグのgD-mVenus-HAコンストラクトを作成し、それを細胞外で結合させるものとして、mCherryのタグ付きの膜結合型単鎖GFP抗体（morphotrap-mCherry）を入手した。そしてgD-mVenus-HA mRNAを動物極側の一割球に顕微注入し、離れた別割球にはmorphotrap-mCherry mRNAを注入した。原腸胚期で固定し、抗HA抗体で免疫染色した結果、mCherryの細胞膜のシグナルと重なって抗HA抗体のシグナルが強く検出された。このことはgD-mVenus-HAが分泌されて細胞間隙を移動してmorphotrap-mCherryに結合したことを示している。この結果と、gD-HAが細胞間隙に検出されないという以前の結果と合わせて考えると、原腸胚期の細胞表面にはgDが結合できる修飾をもつHSが存在しないことを示唆している。gDが結合するHSにはN-sulfoと2位と6位のスルホン酸修飾に加えて3位のスルホン酸修飾（O3S）が必要であることが報告されているので、その修飾酵素であるHs3stの発現パターンをRNA-seqデータベースで調べた。hs3stには６つのパラログがあり、hs3st1は母性因子としてあるが、hs3st3は神経胚期で発現が増大する。そこでgD-HAを発現させた胚を神経胚期で固定して免疫染色して細胞間隙を観察したところ、シグナルは弱いがドット状の分布を示した。このドットがHSへの結合によるものかを検討するため、HS切断酵素のHepIIIを発現させてそのドットが消失するか否かを現在検討中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

新型コロナウイルス対策の緊急事態宣言により、雇用している技術員の実験日数と時間数の短縮により実験に遅れが生じた。加えて、HSの修飾酵素の反応性をチェックするために抗N-sulfo HS抗体（HepSS-1抗体）を用いるが、ハイブリドーマの培養液から調製した抗体が非常に不安定であり、再度ハイブリドーマからマウス腹水より調製し直したため、それを用いる実験に遅れが生じた。

Strategy for Future Research Activity

１）gD-HAを発現させた神経胚を免疫染色して、細胞間隙に認められたドット状のシグナルがHSへの結合によるものかを、HS切断酵素のHepIIIを発現させてそのドットが消失するか否かで検討する。HepIIIはGPIアンカーで細胞表面に結合させ、トレーサーとして蛍光タンパク質mScarletIとOLLASタグを融合させたコンストラクトHepIII-mScarletI-OLLAS-GPI（HepIII-mSI-O-GPI）を共同研究者から入手する。そのmRNAを4細胞期から16細胞期の1割球に顕微注入し、その近傍の1割球にgD-HA mRNAを注入する。原腸胚期で免疫染色してgD-HAの細胞間隙のドット状のシグナルが、HepIII-mScarletI-OLLAS-GPI発現細胞の周囲で消失しているならば、gDのドット状のシグナルがHSとの結合によるものであることが示され、かつO3S修飾を持つHSクラスターの存在が示唆される。同様な実験を、細胞間隙にドット状の局在を示したFGF2についても検討する。
２）HSの5種類の修飾酵素（①Ndst、②Glce、③Hs2st、④Hs6st、⑤Hs3st）のmRNAを単独あるいは組み合わせで発現させることで、種々の修飾バターンをもつHSの生成を目論む。予備的実験では5種全てを組み合わせた混合mRNAを高濃度で顕微注入したところ、細胞異常が認められたことから、各修飾酵素は適度な量を用いなければならないと考えられる。そこで各酵素について、割球あたりの注入mRNA量を変えてトレーサーと共に胚に発現させ、N-acetyl HSあるいはN-sulfo特異抗体で免疫染色することで、もし修飾酵素発現細胞で免疫染色が阻害されたならば、その修飾酵素が活性を有しているかを示すことができる。適量が決まったならば、単独あるいは組み合わせで修飾酵素を発現させ、どの組み合わせの時にgD-HAあるいはFGF2のドット状の局在が増減するかを検討する。これにより修飾パターンと結合特異性との関連性が明となり、修飾パターンの異なるHSクラスターが独立に形成されているか否かが検証可能となる。