2019 Fiscal Year Annual Research Report
Exploration of synaptic mechanism underlying spatial cognitive defect of septin-null mice
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18H02525
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
木下 専 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (30273460)
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2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | シナプス / 樹状突起棘 / スパイン / 滑面小胞体 / セプチン / 長期記憶 / 長期増強 / 海馬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
興奮性シナプス伝達の長期増強(LTP)は、グルタミン酸作動性シナプスへの入力強度に応じてシナプス伝達効率が増加する現象である。より強い入力により一過性の初期相(early LTP, E-LTP)から新規蛋白質合成を伴う持続性の後期相(late LTP, L-LTP)に移行することが固定化ないし長期記憶のシナプス基盤とされているが、不明な点が多い。我々の昨年度までの研究で、①ラット海馬歯状回顆粒細胞(DGニューロン)への電気刺激でL-LTPを誘発すると、アクチン重合とともにセプチン・サブユニットSEPT3がリモデリングすること、②Sept3欠損マウスでは記憶固定化が減弱すること(空間文脈課題)、③その責任領域であるDGニューロンの樹状突起棘(スパイン)内で滑面小胞体(ER)が欠乏すること、④初代培養DGニューロンでのSEPT3欠乏が樹状突起基幹部からスパインへのER伸展を阻害することを見出した。後シナプス領域のERはCa2+放出を介してシナプス伝達や可塑性を制御するとされているが、L-LTPやSEPT3との関係は不明である。そこで本研究では、初代培養DGニューロンを用いて1)L-LTP誘発前後のスパインへのER伸展とSEPT3との関係、2)スパインへのER伸展に関与する細胞骨格因子、を探索・検証した。実験結果から、1) SEPT3はL-LTPに伴うスパイン拡大には必要ではなく、拡大スパインへのER伸展に必要であること、2) 拡大スパインへのER伸展には微小管系は必要ではなく、アクトミオシン系が必要であることが示された。一方、免疫電顕解析から、3) ER近傍におけるSEPT3の局在、4) L-LTP誘発後のスパイン内SEPT3の増加が示唆された。以上および生化学データから、検証可能な作業仮説を立てた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
DGニューロンは興奮毒性に対する耐性が低く脆弱であることや、1個体から活性を保持したまま回収できる細胞数が少ないことなどから、分散培養系を用いたライブイメージング実験系の先行研究はわずかで、当グループでのデータ取得は長らく困難を極めていた。しかし、工夫を重ねて実験手法やプロトコルを最適化することによって培養後の生存率、シナプス形成効率が高まったことと、実験経験を積んで解析対象とすべきシナプス/スパインのクライテリアを厳密化することで安定したデータが取得できるようになりつつある。さらに、テトラサイクリン誘導型発現ベクターによる野生型・変異体蛋白質の急性発現、薬理学的操作、光操作（グルタミン酸photouncaging）を組み合わせて種々のシナプス入力強度を模倣したうえで蛍光ライブイメージングを行うことも最近ようやく可能となった。一方、行動解析では実験協力者（卒業研究学生、修士大学院生）の手技の個人差等により再現性のあるデータ取得が困難であったが、プロトコルの全ステップをゼロベースで見直して統一し、経験の浅い実験者が陥りがちなエラーを潰すことで比較的安定するようになったが、依然として属人的な要素を排除することが困難な実験系であることには変わりなく、今後の課題として残っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
SEPT3がシナプス基部のER近傍に局在し、L-LTP誘発後にスパイン内に移動することを示唆する免疫電顕データや生化学データなどが得られている。一方、小脳プルキンエ細胞ではMYO5A/Myosin-VaがスパインへのER伸展に関与するとの報告（Wagner et al., Nat Cell Biol 2011）があるが、その後の追試はなく、詳細や生理的意義も長らく不明なままである。そこで、これら断片的な情報と上記知見を併せて、新たな作業仮説として「ER近傍のSEPT3とMYO5A（MYO5Bの関与は実験により否定的）がシナプス活動依存的リン酸化によって会合し、スパイン内アクチン線維に沿ってERを伸展させる」を立てた。今後はこの仮説の検証とともに、スパイン内に伸展したERの生理機能の探索を行うことで、記憶固定化ないし長期記憶のシナプス基盤であるE-LTPからL-LTPへの転換メカニズムの一端を明らかにしていく計画である。一方、個体レベルでは、これに相当する行動パラダイム（新規かつ特異な環境刺激によるalertnessの亢進により、弱く短い記憶を強く長い記憶に転換する系）を用いて、その背景にあるノルアドレナリン/ドーパミン系の関与を仮定して薬理学的に検証する。
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