2018 Fiscal Year Annual Research Report
記憶の形成・維持におけるCaMKIIが構成する自己活性型タンパク質複合体の解析
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18H02528
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
実吉 岳郎 京都大学, 医学研究科, 准教授 (00556201)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | CaMKII / Tiam1 / 分子間相互作用 / 酵素活性 / 記憶 / 学習 / シナプス可塑性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
記憶を規定する最小単位のシナプスでは入力刺激を受けると伝達効率および構造に持続する変化が生じる。しかし、一過的な刺激を持続する生化学反応へ変換するメカニズムは不明である。我々は、この過程において酵素（CaMKII）が基質（Rac活性化因子TIAM1）との結合により相互に活性化しあう自己活性化複合体となりシナプス構造を維持することを見出した。さらにCaMKIIとTIAM1以外の基質の結合も発見したため、より大きな概念として記憶の形成・維持には、CaMKIIと基質による自己活性化型タンパク質複合体が必要であるという新しい仮説をたてた。この仮説を立証するため、以下の３つの実験計画を行っている。
計画１ 自己活性化型複合体のできないCaMKIIノックインマウスによる記憶学習解析 CaMKIIノックインマウスを用いた行動テストを行った。恐怖条件付け試験では、ヘテロ接合体マウスは記憶障害が認められた。また、ホモ接合体は、産仔をうまく育てない表現型がみられた。人工授精法で多数のホモ接合体個体の産仔をえる条件を得たので、この方法で行動解析を引き続き行なっていく。
計画２ CaMKIIノックインマウスを用いたCaMKII結合因子の網羅的探索およびリン酸化解析 現在、ノックインマウスの質量分析計を用いたリン酸化解析中である。また、結合分子の解析は免疫沈降可能な特異抗体の選別中である。さらに、培養細胞を使った相互作用解析を行い、いくつかのCaMKII結合タンパク質候補を得ている。
計画３ CaMKII複合体によるシナプス可塑性制御：LIMK1-CaMKII複合体の解析 現在、LIMK1にあるCaMKII結合領域の絞り込みを行なっている。また、CaMKIIによるリン酸化のLIMK1酵素活性にあたえる影響を調べた。CaMKIIによるリン酸化がLIMK1活性を更新することがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画１ 自己活性化型複合体のできないCaMKIIノックインマウスによる記憶学習解析 CaMKIIノックインマウスを用いた行動テストを行った。恐怖条件付け試験では、ヘテロ接合体マウスは記憶障害が認められた。また、ホモ接合体は、産仔をうまく育てない表現型がみられた。人工授精の手法を用いて産仔を得る方法により、効率よくホモ接合体を得ることができていおり、来年度での行動試験での進展が期待できる。
計画２ CaMKIIノックインマウスを用いたCaMKII結合因子の網羅的探索およびリン酸化解析 現在、ノックインマウスの質量分析計を用いたリン酸化解析中である。また、結合分子の解析は免疫沈降可能な特異抗体の選別中である。市販の抗体は、免疫沈降ができても、共沈降分子が得られないものが多い。培養細胞を用いた結合分子探索では、興味深い分子が多数得られているので、ノックインマウス個体からの免疫沈降産物との比較により、脳神経系特異的な相互作用が得られるのを期待している。
計画３ CaMKII複合体によるシナプス可塑性制御：LIMK1-CaMKII複合体の解析 現在、LIMK1にあるCaMKII結合領域の絞り込みを行なっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画１ 自己活性化型複合体のできないCaMKIIノックインマウスによる記憶学習解析 CaMKIIノックインマウスを用いた行動テストを行った。恐怖条件付け試験では、ヘテロ接合体マウスは記憶障害が認められた。また、ホモ接合体は、産仔をうまく育てない表現型がみられた。人工授精の手法を用いて産仔を得る方法により、効率よくホモ接合体を得ることができていおり、来年度での行動試験での進展が期待できる。ウイルスベクターによるヘテロ接合体個体の記憶障害の救出を利用し、CaMKIIによる記憶保持の時間枠を探索する。ツールとしてのウイルス作成と発現制御についての予備実験を始める。
計画２ CaMKIIノックインマウスを用いたCaMKII結合因子の網羅的探索およびリン酸化解析 現在、ノックインマウスの質量分析計を用いたリン酸化解析中である。また、結合分子の解析は免疫沈降可能な特異抗体の選別中である。市販の抗体は、免疫沈降ができても、共沈降分子が得られないものが多い。培養細胞を用いた結合分子探索では、興味深い分子が多数得られているので、ノックインマウス個体からの免疫沈降産物との比較により、脳神経系特異的な相互作用が得られるのを期待している。リン酸化状態の網羅的な解析の結果を個別タンパク質で確認していく。また、抗体の選別終了後、脳組織からのサンプル調整を試みる。
計画３ CaMKII複合体によるシナプス可塑性制御：LIMK1-CaMKII複合体の解析 現在、LIMK1にあるCaMKII結合領域の絞り込みを行なっている。CaMKIIとの結合不全変異体が出来次第、海馬神経細胞でのシナプス構造可塑性実験を分子置換法を用いて検討していく。
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