2018 Fiscal Year Annual Research Report
Study on regulation of lymphocyte development by IKZF family proteins and on molecular pathogenesis of disorders caused by a mutation in IKZF family molecules.
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18H02778
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
森尾 友宏 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (30239628)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大津 真 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (30361330)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / 免疫学 / 臨床 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、患者にての解析結果を下に、モデル系を用いた疾患の病態解明から、IKZFファミリー分子の生理学的役割にまで踏み込んだ研究を行うことを目標としている。
今まで、IKZF3 G158R変異患者のモデルマウスであるIKZF3 G159R Knock in (KI)マウスを用いてB細胞分化異常発症機構を検討してきたが、2018年度はT細胞の分化異常について検討を加えた。その結果、胸腺細胞での分化異常及び、成熟T細胞でのCD3発現低下を確認し、更なる分子病態解析に進んだ。
IKZF1及びIKZF3による生理的転写調節とその障害については、IKZF3wt, KO, KIマウスのPreB細胞、T細胞を材料として、ChiP-Seq, RNASeqを行って検討をすすめた。またIKZF3 G159Rが新たに会合する部位についても探索を行った。その結果、転写開始部位(TSS)周辺を中心に、影響を及ぼす可能性のある遺伝子について同定が進んでいる状況である。
並行してIKZF1-N159S KIマウスを作成する予定であったが、現時点ではknock in constructの作成にとどめている。もう1つのモデル系であるiPS細胞については、正常iPS細胞を用いてknock in変異を入れることとした。iPS細胞のゲノム編集に当たっては、高精度高効率なSNGD法（大阪大学中田慎一郎先生開発）を用いることとした。本方法を用いて、iPS細胞を用いて、モデル変異を効率良く、最小限のエラー率にて導入できることを確認した。
患者由来リンパ腫についてはそのRNASeqデータを、IKZF1変異由来の白血病におけるRNASeqデータと比較検証を行った。また造腫瘍性関連遺伝子の変異解析を含めて検討を進めた。IKZF3患者及びモデルマウスについては、論文化し投稿に至っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
IKZF3-G159R KIマウスを用いた解析で、予定通りT細胞異常の詳細な検討を実施した。得られた結果を下に、CD4，CD8遺伝子promoter, enhancerに対する影響を検討中であり、新たなIKZF1会合部位が同定されようとしている。患者で認められたTh17の減少についてはKIマウスでは認められないことが明らかになった。また今のところマウスではリンパ腫発生を認めておらず、リンパ腫発生機序についての詳細な検討には至っていない。特にhomozygous KIマウスでは腸管病変が出現し、るい痩を呈することから、今後は腸管における免疫状態を検討する方向性も考えている。
IKZF1-N159S KIマウスについては、IKZF2の変異情報も入っている状況であり、今後並行してKIマウスを作成する予定とした。その間にヒト検体を用いてN158I変異についての検討を進めた。
IKZF1, IKZF3iPS細胞については、患者由来のiPS細胞樹立が出来ないため（患者検体が手に入らないため）、正常iPS細胞を用いてknock in変異を入れることとした。iPS細胞からのB細胞分化技術は確立していないが、将来的な解析に向けて、樹立は行っておく予定である。またiPS細胞においてのKI変異導入技術は確立したものがないが、SNGD法を用いることによって、容易にまた高効率に樹立可能であることが明らかになっている。
リンパ腫については、患者検体を中心に検討を進めているが、融合遺伝子探索や、全ゲノム解析などを併用して、できるだけの情報を得る予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も病態の再現と、病態解析を継続する。IKZF1 N159S KIマウスについては、constructもできているため、作成にとりかかる予定である。一方、新規IKZF2患者の変異情報及び患者の症状、免疫学的データについての情報があり、IKZF1に比べて解析が進んでいないIKZF2のモデルマウスの作成とIKZF1変異マウス作成のいずれを先行するかについては、検討が必要と考えている。
IKZF3 G159R KIマウスにではIKZF1のZF5, ZF6（IKZFタンパク相互間の会合に重要）をheteroで欠失したマウスと交叉して、表現型を検討することにより、IKZF1/IKZF3ヘテロダイマー（本マウスでは存在しない）とIKZF3ホモダイマーの病態関与を判別する。これによりheteromeric interferenceの根拠を提示する。
IKZF1, IKZF3とIKZF2, ILZF4（EOS）の相互作用については、COS-7細胞やIKZF knock-out pre-B細胞株への各種遺伝子導入で共局在及びそのパターンについて、検討を進める。
IKZF3 G159R KIマウスではリンパ腫がまだ発生していないが、経過を追い、特定の時点でリンパ組織を採取して、CNV解析、定量的造腫瘍性関連遺伝子解析、RNASeqなどで変異の導入や蓄積を検討する。
正常あるいは変異IKZF3では既にChIP-seqで転写調節領域を抽出している。今後は、IKZF1, IKZF3のconsensus sequence及びChIP-seqで同定された変異IKZF3が会合する領域について、レポーター遺伝子アッセイで機能解析するべく、基礎検討を開始する。
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| Remarks |
現在Rockefeller Universityと本プロジェクトに関連する共同研究を開始している。
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Research Products
(3 results)
