2019 Fiscal Year Annual Research Report
Investigation of mechanisms for leukemia developments and progress by single cell profiling of mesenchymal niches
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18H02841
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
国崎 祐哉 九州大学, 大学病院, 准教授 (80737099)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 骨髄微小環境 / 白血病 / シングルセル解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
造血幹細胞ニッチの構成細胞として、CXCL12-abundant reticular (CAR)細胞、NG2陽性細胞、レプチン受容体陽性細胞など血管周囲の間葉系幹前駆細胞の重要性が示されている。これらの研究結果は、上述の間葉系細胞の修飾によっておこる造血幹細胞数や活性の変化に基づくものであり、骨髄内の造血幹細胞の分布からその環境を解析するというアプローチはされていなかった。申請者は、骨髄の３次元イメージング技術を確立し、造血幹細胞の骨髄内実測分布とコンピューターシミュレーションによる確率的な分布を比較解析することにより、NG2とレプチン受容体という異なる表面マーカーを発現する間葉系幹細胞によって構成される細動脈ニッチと骨髄洞ニッチが、造血幹細胞の静止状態の維持、細胞増殖という異なる機能を支持していることを世界で初めて明らかにした。これらの間葉系幹細胞活性を持つ細胞群の機能解析より、NG2陽性細胞およびレプチン受容体陽性細胞も100%の自己複製能、多分化能を示さず、不均一性を持つと考えられる。また、元来、中胚葉由来と考えられていた骨髄間葉系幹細胞の中に、神経堤由来の分画が存在することも示されている。また、近年、癌の発症や進展においてもその微小環境との相互作用の重要性が明らかとなっている。本課題では、造血支持に不可欠である間葉系幹前駆細胞をその起源やシングルセルレベルでの網羅的な遺伝子解析により細分化し、その知見を基にして現在までに明らかになっていない造血器腫瘍を支持する骨髄微小環境を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
急性白血病のマウスモデルであるMLL-AF9モデルマウス骨髄より分離した間葉系幹細胞では、CXCL12、SCFといったニッチ因子の遺伝子発現の低下に加えて、Angpt-1、Angpt-2といった血管修飾因子の発現に著明な変化が認められた。また、同マウスの骨髄の三次元イメージング技術を用いた解析において、CD31を高発現する血管の増加や血管構造の粗造化が認められ、白血病細胞が、血管および血管周囲細胞に影響を与えることにより正常造血を抑制し、白血病の進展に有利な環境、すなわち白血病ニッチを形成していることが示唆された。７週齢と120週齢の高齢マウス骨髄や骨髄増殖性疾患類似病態を示す血球特異的Ragnase-1欠損マウスから既知のマーカーでソートした間葉系幹細胞や血管内皮細胞集団のRNAシーケンスを行い双方で有意に上昇を認めた因子Xをすでに特定している。この因子Xについて、細胞特異的に欠損や過剰発現が可能となるfloxマウスと血管内皮特異的Cre(Cdh5-creERT2)マウスや骨髄間葉系幹細胞で発現する(Leptin受容体-cre)マウスを交配することにより実験マウスモデルを完成させた。120週齢マウスから採取した骨髄間葉系幹細胞においてテロメア保護分子POT1aの発現の著明な低下が認められた。POT1aは、シェルタリン複合体の構成分子として、テロメアにおけるDNA損傷反応を防止する一本鎖DNA結合タンパク質である。POT1aは、造血幹細胞の自己複製能および分化能力を維持するために必須であることが報告されており、テロメアの保護は「幹細胞プログラム」を維持するために重要であると考えられたため、このPOT1aを間葉系幹細胞から欠損させるマウス(NG2-cre/POT1aflox/flox)を作製した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究にて作製した血管内皮Cre(Cdh5-creERT2)や骨髄間葉系幹特異的(Leptin受容体-cre)因子X欠損マウスにおいて、MLL-AF9細胞やRegnase-1欠損細胞を移入することで、白血病や骨髄増殖性腫瘍モデルを作製する。それぞれのモデルにおける造血器腫瘍の進展や骨髄微小環境の再構築過程を分析することで、造血器腫瘍の病態、進展における骨髄微小環境由来の因子Xの重要性を明らかにする。
POT1aを間葉系幹細胞から欠損させるマウス(NG2-cre/POT1aflox/flox)は、骨格系の発育障害を認めた。NG2-cre/POT1aflox/floxマウスの骨髄より間葉系幹細胞集団を既知のマーカーで分離ソートし、RNAシーケンスにより遺伝子発現解析を行い、骨形成や造血幹細胞維持に重要な因子の発現低下、GO解析により骨や骨格形成に関わる遺伝子群の発現低下が認められ、骨髄間葉系幹細胞に機能異常を来していることが示された。次年度は、NG2-cre/POT1aflox/floxマウスにおける骨髄間葉系幹細胞「pericyte」の機能異常が血管内皮細胞の機能にどのような影響を与えているか、3次元イメージングで骨髄血管構造を観察し、また細動脈、骨髄洞血管内皮細胞を分けてその遺伝子プロファイリングを行うことで、血管周囲間葉系幹細胞と２種類の血管内皮細胞(細動脈と骨髄洞)との相互作用を明らかにする。
NG2-cre/POT1aflox/floxマウス骨髄から分離可能な間葉系幹細胞は、数が少なく、培養増殖が非常に困難なため、培養している間葉系幹細胞からPOT1aを欠損させる実験系を確立し、その細胞を用いて、骨、脂肪、軟骨組織への分化実験、シングル細胞シーケンスなど分子生物学的な実験を行う。
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