2018 Fiscal Year Annual Research Report
腹水中exosomeをターゲットとした新たな治療法の開発
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18H02882
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University of Medicine |
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Principal Investigator |
大辻 英吾 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 教授 (20244600)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小西 博貴 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00448739)
有田 智洋 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (00756794)
小松 周平 京都府立医科大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師 (40578978)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | exosome / microRNA / 腹膜播種 / 消化器癌 / 腹水 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌由来exosomeの機能阻害による細胞間情報伝達阻害により引き起こされる癌細胞の悪性形質の変化を包括的に解析検討を進めている。exosomeの阻害方法については、1)分泌阻害、2)物理的阻害、除去、3)取り込み阻害、に注目した。
exosomeは、細胞内の多抱性エンドソーム（multivesicular body: MVB）を経由して分泌される細胞外小胞体として定義される。エンドソームが成熟する際にはセラミドのエンドソーム内への取り込みが必要であるが、SMPD3(nSMase2)はこの取り込みに関与する分子として知られている。また、MVBから小胞体が細胞外に分泌する際の細胞内の移動と細胞膜との癒合の制御にはRab GTPase family、とりわけRab27が重要な役割を担っている。そこでまずこの２分子に着目し、exosomeの分泌阻害による腫瘍進展の制御の可能性について検討した。nSMase2およびRab27をsiRNAを用いてノックダウンした胃癌細胞株（MKN45）において、分泌されるexosomeに内包されるmiRNAの内、代表的なmiRNAであるmiR-16とmiR-21は、ノックダウンにより発現が低下しており、分泌が抑制されている可能性があることを確認した。マウスを用いた腹膜播種モデルを作成し、この細胞を用いることで播種が抑制されるかどうか現在確認中である。
また、悪性腹水中の腫瘍細胞由来exosomeの除去による播種進展抑制効果についても検討した。継時的（８時間毎）に細胞培養液を回収し、超遠心法によりexosomeを除去した培養液を再び癌細胞（NUGC4）に添加するというプロトコールで細胞のproliferationについて検討したところ、継時的なexosome除去は腫瘍細胞の増殖を有意に抑制していた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
in vitroにおける実験計画は概ね順調に進行している。得られた結果からマウスを用いた動物実験を現在進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
[exosome取り込み阻害のもたらす癌悪性形質の変化の解析(in vitro)]
癌由来exosomeをrecipient cellが取り込むことを阻害して得られる抗腫瘍効果を検討する。 exosomeはエンドサイトーシスにより取り込まれるため、エンドサイトーシス阻害作用を有するサイトカラシンD(Abcam社)でMeT-5Aを処理し、癌細胞と腹膜細胞の接着能の変化につ いて検討する。また、同処理を癌細胞に行い、浸潤・遊走、増殖アッセイにて観察評価を行う。取り込み阻害の評価については培養液中に分泌されたexosomeを超遠心法で抽出し、PKH67などでラベリングしたのちにサイトカラシン処理をした細胞へ添加したのちに蛍光免 疫染色法で観察を行う。また、取り込み阻害効果が得られない場合はマクロピノサイトーシ スを促進するEGFRレセプターの阻害を利用することとする。
[exosome分泌阻害のもたらす腹膜播種形成阻害の解析(in vivo) ]
スフィンゴミエリナーゼのノックダウン処理をした各消化器癌細胞株をマウス腹腔内へ投与し、播種形成の阻害効果について検討を行う。ノックダウン効率に問題が生じる場合は GW4869処理等によるexosome分泌阻害処理をした癌細胞株の腹腔内投与を検討する。
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