2018 Fiscal Year Annual Research Report
神経堤細胞由来間葉系幹細胞と細胞集塊培養技術を用いた新規歯周組織再生療法開発
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18H02977
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
栗原 英見 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 教授 (40161765)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
加治屋 幹人 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 助教 (00633041)
池谷 真 京都大学, iPS細胞研究所, 准教授 (20442923)
水野 智仁 広島大学, 病院(歯), 講師 (60325181)
藤田 剛 広島大学, 医歯薬保健学研究科(歯), 准教授 (80379883)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 間葉系幹細胞集塊 / C-MSCs / 神経堤細胞由来間葉系幹細胞 / iPS細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに申請者らは、人工材料を必要としない細胞移植療法として、間葉系幹細胞(MSCs)と細胞自身が産生する細胞外基質(ECM)を利用して間葉系幹細胞集塊Clumps of MSCs/ECM complexes (C-MSCs)を樹立していた。本研究では、顎顔面の発生に関与する神経堤細胞(NCC)由来MSCsとこの細胞集塊培養技術を応用して、より効果的な歯周組織再生療法開発を目的とする。
研究初年度では、ゼノフリー・血清フリー・フィーダー細胞フリーの条件(XF条件)でヒトiPS細胞からNCCを経てMSCsに高効率に誘導する方法を確定させた(XF-iNCC-MSCs樹立)。さらに、XF条件で集塊化させる方法を樹立した(XF-C-iNCC-MSCs樹立)。
XF-C-iNCC-MSCsは骨髄由来MSCsからXF条件で作成されるXF-C-BMMSCsと比較して同等の多分化能を有していることを示した。また、MSCsのポジティブマーカーであるCD73, CD90, CD105を90％以上レベルで発現し、ネガティブマーカーであるCD14, CD11, HLA-DRの発現は0.1%未満であることを確認した。
さらに、得られたXF-C-iNCC-MSCsの骨再生効果をSCIDマウス頭蓋冠欠損モデルに移植することで評価した。対照として、移植無し群、XF-C-BMMSCs移植群を用意した。その結果、XF-C-iNCC-MSCsの移植がXF-C-BMMSCsと同等の効果的な骨再生を促進することをマイクロCTおよびHE染色による解析によって明らかになった。さらに、ヒト特異vimentin抗体を用いた免疫染色の結果、移植されたヒト細胞が再生骨の骨内に認められた。これらのことから移植された細胞自身が骨細胞分化を起こすことによって骨再生を促進することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、ヒトiPS細胞からNCCを経て得られるMSCsをXF条件で作成し、これに申請者らが独自に開発した集塊培養技術を応用し、歯周組織再生に効果的な立体的組織を生体外から作製・供給する技術開発基盤研究である。
研究初年度には、当初の予定通り、XF-iNCC-MSCsを作成し、それを集塊化することで、XF-C-iNCC-MSCsを得ることができた。さらに、XF-C-iNCC-MSCsに骨分化誘導をほどこすことで、in vivoレベルで高い骨形成能を発揮させることにも成功している。
本研究課題申請時に計画していた内容で、XF-C-iNCC-MSCsに軟骨誘導を施し、その移植が軟骨内骨化を経てより効率的に骨再生を促進するかを調べる項目が未完となった。この項目は次年度に達成させる必要がある。
以上のことから、本研究課題は概ね計画通りに進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述したとおり、初年度に未達成であった軟骨誘導を施したXF-C-iNCC-MSCsの細胞性質をin vitroおよびin vivoで確認する必要がある。特に、軟骨誘導を施されたXF-C-iNCC-MSCsの移植は、軟骨内骨化の様式を経て、大規模な骨再生を達成すると期待できる。
この確認と並行して、当初の予定通り、3Dバイオプリンターであるレジェノバを応用して、4x4x4mmの型にXF-C-NCC-iMSCsを複合化することで、歯周組織再生療法に有効な立体組織の構築を試みる。実際には、XF-C-NCC-iMSCsや骨分化誘導XF-C-NCC-iMSCs、軟骨分化誘導XF-C-NCC-iMSCsを任意の配置で複合化させ、その組み合わせの結果得られる立体組織の機能評価をin vitroにて解析する。解析方法は、遺伝子発現をDNAマイクロアレイで、組織学的には免疫染色とマイクロダイセクションを用いて、部位ごとの細胞性質まで確認する。
また、得られた立体複合組織を、免疫不全SCIDマウスの皮下に移植し、自発的な硬組織形成が得られるかを、マイクロCTおよび組織学的検討によって評価する。
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[Journal Article] Type I collagen deposition via osteoinduction ameliorates YAP/TAZ activity in 3D floating culture clumps of mesenchymal stem cell/extracellular matrix complexes.2018
Author(s)
Komatsu N, Kajiya M, Motoike S, Takewaki M, Horikoshi S, Iwata T, Ouhara K, Takeda K, Matsuda S, Fujita T, Kurihara H.
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Journal Title
Stem Cell Res Ther
Volume: 9(1)
Pages: 342
DOI
Peer Reviewed / Open Access
