疾患iPS細胞を用いたGNAS-cAMP経路の骨芽細胞分化石灰化メカニズム解明

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H03007
• Research Institution: Tokyo Dental College
• Principal Investigator: 東 俊文 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (00222612)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 柴原 孝彦 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (50178919) ; 齋藤 淳 東京歯科大学, 歯学部, 教授 (60266559) ; 中村 貴 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (80431948) ; 小野寺 晶子 東京歯科大学, 歯学部, 講師 (90637662) ; 齋藤 暁子 東京歯科大学, 歯学部, 助教 (90722835)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: Hedgehog / GNAS / ｃAMP / iPS

Outline of Annual Research Achievements

Gorlin症候群iPS細胞iPS細胞を骨芽細胞誘導すると過剰な石灰化をきたし、Hedgehog経路阻害薬処理により過剰灰化が抑制された。　一方、MacCuneAlbright症候群iPS細胞由来骨芽細胞は石灰化が抑制されており、Hedgehog情報経路を強制的に活性化させると石灰化が進む。このとき　McCuneAlbright症候群iPS細胞ではcAMP産生能力が上昇しており、特にPTCHやアドレナリン刺激によるcAMP産生はコントロールより増加、さらにｃAMPの過剰状態は遷延した。　Gorlin症候群の石灰化過剰状態に寄与すると思われる転写因子候補４つを同定した。Gorlin症候群患者iPS細胞の検討から、Hedgehog情報過剰下では　cAMP情報は抑制されており、MAS症候群iPS細胞の検討では、GNAS情報過剰下では　cAMPは過剰となりhedgehogは抑制されている。GorlinではHedgehogを抑制すれば石灰化過剰は是正され、MASではHedgehog経路を活性化させると石灰化抑制は改善される。したがって、石灰化はHedgehog経路の過剰あるいは抑制がそのまま石灰化過剰　抑制に結び付く。と考えられた。さらに　これらの情報から　Drug　repositioning　を念頭に　治療薬開発に結び付けるため　薬剤ライブラリーを用いた解析系を確立した。まずは　各々iPS細胞から　PDGFRα陽性、Ｓｃａ1 陽性　MSC細胞を樹立しストックした。その細胞を各々の条件により分化誘導しALP陽性となる薬剤をピックアップする方法により　効果のある薬剤を同定する。また、MASにおける未熟骨芽細胞の治療としてHedgehog情報経路促進により効果を検討する。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画通り　Gorlin iPS細胞と　MAS iPS細胞を樹立し、その各々における石灰化を評価した。また各々の情報経路についてGorlinではHedgehog経路の過剰、MASではcAMP産生過剰状態にあることを確認いした。さらにｃAMPについては　非常に不安定で一過性発現上昇となっているので、経時的に蛍光発光によりｃAMP発現をリアルタイムに計測することを可能となっている。

Strategy for Future Research Activity

Gorlin症候群の石灰化過剰状態に寄与すると思われる転写因子候補４つの石灰化における役割を決定する。cAMP過剰状態におけるこれら転写因子の働きを解明する。ｃAMPの発現を経時的に蛍光によりモニターする蛍光タンパク質Flaminodoのレンチウイルスベクターを作成し　GorliniPS MASiPS両者におけるGNAS活性化時の蛍光強度を経時的に計測する。さらにｃAMP細胞内濃度とhedgehog活性化程度を評価し各々の疾患を治療する薬剤開発を行う