2019 Fiscal Year Annual Research Report
Formation and repair mechanisms of radiation-induced DNA-protein cross-links
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18H03374
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
井出 博 広島大学, 統合生命科学研究科(理), 教授 (30223126)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平山 亮一 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 放射線医学総合研究所 重粒子線治療研究部, 主任研究員(定常) (90435701)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 放射線 / DNA損傷 / 修復機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA-タンパク質クロスリンク（DPC）のゲノム損傷としての位置づけを明らかにする目的で，DPCの生成機構および修復機構を調べた。
DPC生成機構：放射線が誘発するDPCは，隣接する鎖切断の違いにより三つのタイプに分けられる：隣接する鎖切断がないDPC（Type 1），一本鎖切断に隣接するDPC（Type 2），二本鎖切断に隣接するDPC（Type 3）。これまでの研究で，DNAに結合しヌクレオソーム構造を形成するコアヒストンおよびリンカーヒストンがType 1 DPCに含まれることを明らかにした。本年度はDPCに含まれるタンパク質の分析を引き続き行った。PARP1およびKU70はDNA鎖末端の脱塩基部位に不安定なSchiff塩基を形成し，Type 2・3 DPCを形成する可能性がある。そこで，X線照射したマウスSCCVII腫瘍から精製したDNAをDNase Iで消化し，SDS-PAGEで分離後，Western blotにより各タンパク質の有無を調べた。しかし，PARP1およびKU70のDPC形成は認められなかった。
DPC修復機構：Type 3 DPC として，Topoisomerase 2が二本鎖切断末端にトラップされたTOP2ccの修復機構を in vivoおよび in vitro調べた。TOP2ccは，4つの経路（プロテアソーム依存・非依存経路およびTDP2依存・非依存経路）で修復されることが示唆された。さらに，TDP2は，プロテアーゼ分解を受けていないTOP2ccをDNAから直接切除できることを明らかにした。また，DPCに含まれるタンパクはかさ高く，原子間力顕微鏡（AFM）で可視化分析できる可能性がある。DPCのモデルとして，アビジン-ビオチン標識したDNA損傷がAFMで可視化できることを示し，DPCの生成と修復を追跡できることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
放射線が誘発するType 2およびType 3 DPCに関して，修復タンパクとDNA損傷（脱塩基部位）の特異的反応により生成する可能性を検討し，PARP1およびKU70が含まれないことを明らかにできた。また，DPC修復については，Type 3 DPC としてTOP2ccの修復機構を調べ，4つの経路（プロテアソーム依存・非依存経路およびTDP2依存・非依存経路）で修復されること明らかにできた。研究2年度に予定していた実験に概ね着手し，成果が得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
DPC生成機構：Type 2 DPCおよびType 3 DPCでは，特定のDNA代謝酵素（TOP1・TOP2）がトラップされる。TOP1およびTOP2は，酵素が作用するDNA近傍に損傷が存在すると，反応中間体がトラップされDPCを形成すると予想される。そこで，LETの異なる放射線，過酸化水素，メチルメタンスルホン酸等で細胞を処理することで様々なタイプのDNA損傷をゲノムに誘発し，DPC形成の有無を調べ，反応中間体をトラップするDNA損傷を明らかにする。
DPC修復機構：DPCでは非常にかさ高いタンパク質がDNAに固定化されているため，修復が阻害される。修復では，プロテアーゼの作用によりDNA-ペプチドクロスリンクに消化され，その後，これが除去されると予想される。DPC修復にプロテアソームが関わっているかどうか調べるため，プロテアソーム阻害剤の影響を調べる。また，DNA-ペプチドクロスリンク切除に関わる可能性があるエンドヌクレアーゼおよびジエステラーゼ，損傷乗り越え合成に関わる可能性があるTLSポリメラーゼのノックアウト細胞の放射線感受性およびDPC修復動態を調べる。
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