2019 Fiscal Year Annual Research Report
Induction of vasculogenesis and angiogenesis in three-dimensional tissues by using protein expressions with mRNA delivery
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18H03537
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| Research Institution | Tokyo Women's Medical University |
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Principal Investigator |
小林 純 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (20385404)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秋山 義勝 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (20349640)
長瀬 健一 慶應義塾大学, 薬学部(芝共立), 准教授 (10439838)
増田 信奈子 東京女子医科大学, 医学部, 助教 (30342851)
中山 正道 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (00338980)
辰巳 公平 奈良県立医科大学, 医学部, 准教授 (70555432)
山岡 哲二 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 部長 (50243126)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 細胞シート / 血管新生 / 脈管形成 / 血管内皮前駆細胞 / mRNA送達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 三次元細胞シート組織での脈管形成モデルの構築
ヒト培養細胞からなる3D組織にVEGF mRNAを送達し、血管内皮細胞ネットワーク形成を誘導するモデル構築を検討した。三種類のヒト培養細胞株（293FT, HEK293, HeLa）のうち、主要な血管新生因子の分泌が少なく、かつ温度応答性培養皿を用いて細胞シートを回収できたのはHeLa細胞であった。HeLa細胞をモデルとして用いて、VEGF mRNA送達したHeLa細胞シートの間にGFP-HUVECを挟み、積層化組織内でのGFP-HUVECの挙動を観察した。VEGF mRNA送達せず培地中にVEGFを添加しただけの場合、VEGF濃度に関わらずGFP-HUVECの挙動に変化が見られなかった。一方、VEGF mRNA送達群は対照群と比較してHUVEC細胞数が多く伸展した。これは、HeLa細胞シートから分泌されたVEGFが傍分泌によって積層化細胞シート内GFP-HUVECに作用したことを示唆する。以上より、mRNA送達による積層化細胞シート組織内部へのタンパク質送達の可能性が示された。
2. 三次元積層化細胞シート組織での血管新生モデルの構築
移植可能なVEGF分泌肝細胞シート組織の作製を検証するため、温度応答性培養皿でラット初代肝細胞を培養、VEGF遺伝子を導入したのち、別の培養皿に転写したところ、転写後の肝細胞シートはヒトVGEFを分泌した。また、新生仔ラットから採取した血管内皮細胞を含む心筋細胞を温度応答性培養皿でシート状に培養、VEGF mRNA送達して培養5日後にCD31陽性細胞を観察した。VEGF mRNA送達していない対象群では血管内皮細胞は円形であったが、VEGF mRNA送達群では毛細血管様のネットワーク形成が観察された。以上のことから、mRNA送達によりVEGFを分泌する移植可能な肝・心筋細胞シートを作製できることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
培養細胞だけでなく初代細胞から成るシート組織へのmRNA送達と、血管内皮細胞を含む三次元細胞シート組織の構築手法の条件検討がなされており、概ねではあるが順調に進捗している。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. 三次元細胞シート組織での脈管形成モデルの構築
昨年度に引き続き、三次元細胞シート組織内で血管内皮細胞の脈管形成を誘導する。具体的には、ヒト培養細胞シートの間にヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）あるいは血管内皮前駆細胞を導入して三次元培養を行い、mRNA送達により誘導された血管新生因子の分泌によって脈管形成を誘導する。また、初代肝・心筋細胞シートから成る積層化組織における脈管形成についても引き続き検証する。
2. 三次元積層化細胞シート組織での血管新生モデルの構築
昨年度に引き続き、核酸送達した細胞シートを実験動物に移植し、宿主からの血管新生を誘導する。具体的には、VEGF mRNAあるいはプラスミドを送達した肝・心筋細胞シート組織をラット皮下に移植し、移植細胞シート組織の生存率および移植部位周囲の血管新生能を評価する。
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