2020 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis of the epilepsy-related protein complex LGI1-ADAM22-PSD-95 and its regulatory factors
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18H03983
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
深井 周也 京都大学, 理学研究科, 教授 (10361792)
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2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 構造生物学 / 分子間相互作用 / 膜受容体 / てんかん / シナプス / 足場タンパク質 / パルミトイル化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経の活動には、シナプスで機能する多様な膜受容体複合体が重要な役割を担っており、その機能異常は神経関連疾患を引き起こす。本研究では、てんかんや痙攣に関連するリガンド－膜受容体複合体LGI1-ADAM22とその下流エフェクターであるPSD-95やStargazinに焦点を当てる。LGI1-ADAM22-PSD-95-Stargazin複合体の構造研究により、膜を介したシグナル伝達機構と病態発症の仕組みを理解して、将来的な疾患の予防や改善の基礎となる分子構造基盤を確立する。
昨年度までの研究の結果、当初予定していたパルミトイル化を受けたPSD-95の調製が想定以上に困難であること、また、PSD-95の脱パルミトイル化酵素であるABHD17ファミリーの結晶化も困難であることを受けて、新たにADAM22の機能発現に重要なシグナル伝達調節タンパク質である14-3-3の研究を開始した。14-3-3はリン酸化されたADAM22と細胞内で結合し、ADAM22をシナプス膜上に安定に保持する役割を担う。14-3-3とADAM22のリン酸化ペプチドとの複合体の立体構造決定によって、その相互作用作用機構を明らかにすることを目指した。14-3-3とリン酸化領域との相互作用は、真菌が生産する有機化合物fusicoccin（FC）の影響を受けることが一般的に知られている。ADAM22のリン酸化ペプチドとの結合状態で生じる間隙を埋めるようにFCが結合すると14-3-3とADAM22との親和性が増加する。FC誘導体によってADAM22のシナプス膜上での安定性を向上させ、てんかん病態を改善する可能性を検討するために、FCも含めた三者複合体の結晶構造解析によってFCの作用機構を明らかにすることも検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度は、東京大学から京都大学への研究設備の移設に加えて、新型コロナウイルス感染対策のために研究活動が制限されたこともあり、100%の状態で研究を進めることが困難であった。しかし、限られた条件の中で実行可能な実験を行うことで、予備的ながら14-3-3とADAM22の二重リン酸化ペプチドとの複合体の結晶構造を3.2 Å分解能で決定することができた。FCも含めた三者複合体の結晶化については、結晶は得られたもののFCの電子密度を観測できなかった。等温滴定型カロリメトリーを用いた相互作用解析でも、FCによる親和性の明確な向上は観測できなかったので、他のFC誘導体も含めて親和性を向上する化合物を検討する必要があると考えている。昨年度、結晶構造解析によって明らかにしたPSD-95の3番目のPDZドメインによるADAM22のC末端のPDZ結合モチーフの認識機構については、生理研・深田正紀教授との共同研究の成果の一部として論文に発表することができた。脱パルミトイル化酵素については結晶化の目処が立っていない状況ではあるが、全体としては概ね順調に進展したと評価する。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究では、LGI1とADAM22がシナプス間隙を跨いで形成すると考えられる2:2の会合体の立体構造を明らかにしたが、軸索起始部の同一膜上で形成される可能性がある3:3の会合体については立体構造を予測するにとどまっている。クライオ電子顕微鏡解析では比較的明瞭に3:3の会合体の二次元像を観測しているが、粒子数が少なく、単粒子解析による立体構造決定には至っていない。昨年度は研究活動の制限などもあって予定どおりに進められなかったが、今年度は試料の調製法を改善することで、モデル構築が可能な分解能で単粒子解析を行いたい。また、14-3-3とADAM22の二重リン酸化ペプチドとの複合体の結晶構造解析については、電子密度が不明瞭な領域が残っているので、結晶化条件や試料調製の方法を検討して改善したい。
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[Journal Article] Canonical versus non-canonical transsynaptic signaling of neuroligin 3 tunes development of sociality in mice2021
Author(s)
Yoshida T, Yamagata A, Imai A, Kim J, Izumi H, Nakashima S, Shiroshima T, Maeda A, Iwasawa-Okamoto S, Azechi K, Osaka F, Saitoh T, Maenaka K, Shimada T, Fukata Y, Fukata M, Matsumoto J, Nishijo H, Takao K, Tanaka S, Okabe S, Tabuchi K, Uemura T, Mishina M, Mori H, Fukai S.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 12
Pages: 1848
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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