CRISPRライブラリースクリーニングによるリンパ腫発症の遺伝子基盤の統合的理解

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18H04035
• Research Institution: National Cancer Center Japan
• Principal Investigator: 片岡 圭亮 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, 分野長 (90631383)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白石 友一 国立研究開発法人国立がん研究センター, 研究所, ユニット長 (70516880)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 悪性リンパ腫 / CRISPR

Outline of Annual Research Achievements

成人T細胞白血病リンパ腫や節外性NK/T細胞リンパ腫などの難治性リンパ腫における網羅的な遺伝子解析により多数の新規遺伝子異常が同定されてきたが、その多くで生物学的な役割は不明なままである。本研究では、CRISPRスクリーニングを用いて、難治性リンパ腫で認められる機能喪失型の異常がリンパ腫発症に果たす役割を高効率に解明することを目指す同時に、リンパ腫発症に寄与することが判明した遺伝子異常を個別に導入することで、様々な遺伝子異常を持つリンパ腫モデルを得ることを目指す。さらに、同モデルを用いて、遺伝子異常に応じた分子病態や薬剤感受性の違いを明らかにすることを試みる。
具体的には、難治性リンパ腫で新規に同定された異常の中で、機能喪失を引き起こすと予想されるものを標的とするsgRNAを発現するカスタムライブラリーをGibson Assembly法を用いて構築した。標的とする遺伝子異常としては、遺伝子変異、コピー数異常、構造異常などのあらゆる遺伝子異常を対象とした。このsgRNAライブラリーをレンチウイルスによりCas9発現マウスから純化した造血幹前駆細胞分画に導入し、同系マウスに静注により移植した。造血器腫瘍が発症した場合には、表面マーカーや病理組織などを調べることにより表現型を明らかにすると同時に、腫瘍DNAを用いて、sgRNA毎に挿入されたバーコードのアンプリコンシーケンスを実施して、発症した腫瘍で濃縮されているsgRNA（移植時と比較）を同定した。その結果、野生型マウスを用いて本実験を実施した場合、ライブラリーの導入により悪性リンパ腫を含む様々な造血器腫瘍が2～3か月で発症することが明らかとなった。その造血器腫瘍には、特定の遺伝子を標的とするsgRNAが濃縮されており、これらの腫瘍のドライバーとして機能することが示唆された。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

当初の予定通り、CRISPRライブラリの作成、および、野生型マウスにおける移植実験を行うことが出来た。さらに、それらのマウスにおいて、一定期間後に悪性リンパ腫を含む造血器腫瘍が発症し、一部の遺伝子を標的とするsgRNAが濃縮されていることが明らかとなった。本研究計画を行う上で最も重要なポイントが初年度より達成されたことから、計画以上に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

次年度は、本実験を継続し、様々の異常を持つリンパ腫モデルを作成すると同時に、低～中頻度にリンパ腫を発症すると予想される遺伝子改変マウス（HBZ発現マウスやPd-l1 3′-UTR条件的ノックアウトマウス）を用いて、腫瘍化を促進する遺伝子異常の同定も試みる。さらに、上記の実験により得られたリンパ腫モデルを用いて、遺伝子異常に応じた分子病態や薬剤感受性の違いを検証する。具体的には、各々の遺伝子異常を持つリンパ腫モデルから腫瘍細胞を採取し、RNAシーケンスによる遺伝子発現解析を行い、各々の遺伝子異常が引き起こす遺伝子発現パターンの特徴について明らかにする。同時に、それらを相互に比較することで、それぞれの共通点や相違点を明らかにする。また、表面マーカー解析により、リンパ腫の起源となった正常細胞を同定し、遺伝子発現パターンを比較する。