2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development and clinical application of low molecular chemicals that modulate myosin light chain kinase for the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
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18H04050
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| Research Institution | National Cardiovascular Center Research Institute |
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Principal Investigator |
北風 政史 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 病院, 部長 (20294069)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山崎 悟 国立研究開発法人国立循環器病研究センター, 研究所, 室長 (70348796)
塚本 蔵 大阪大学, 医学系研究科, 助教 (80589151)
高島 成二 大阪大学, 生命機能研究科, 教授 (90379272)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ミオシン調節軽鎖キナーゼ / 肥大型心筋症 / 心不全 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトcMLCK活性を特異的に阻害する25系統の低分子化合物を同定し、phostag PAGEを用いて実際に基質のリン酸化が低下することを確認した。これらの化合物を用いて動物実験が可能か検討するために、ラットおよびサルのcMLCKでも阻害作用を確認し、阻害活性を有する事を確認した。
化合物の合成展開に当たり結晶構造を得ることが重要と考えた。そこで、cMLCK特異的阻害剤とcMLCKの共結晶構造解析を行うために、cMLCKの大量精製および単分散条件の検討を行った。Sf21昆虫細胞にバキュロウイルスを用いてcMLCKを10Lの大量精製培養システムを構築し、cMLCKを大量に安定して発現させることができた。活性に影響しない程度にcMLCKのN末端を欠損させた結果、単分散を得ることが出来た。また、cMLCKの結合蛋白質であるカルモジュリンも大腸菌のシステムを用いて構築し、大量精製に成功した。これらcMLCKとカルモジュリン蛋白質を混合し複合体を形成させた後、ゲルろ過を実施したところ、推測される分子量の高さに単分散して回収できた。約1000条件での結晶化条件を検討し、結晶化を得ることが出来た。この結晶を用いて現時点で2.65Åでの結晶解析を行う事に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
MLC2vのリン酸化を低下させる低分子化合物を得ることに成功し、動物実験でも使用できることが確認できた。さらに化合物の標的蛋白質の結晶構造を得ることが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）得られた低分子化合物を培養心筋細胞に対して作用させ、MLC2vリン酸化の減少、心筋収縮性抑制効果を確認する。
２）肥大型心筋症を引き起こすサルコメア蛋白質の変異を導入した培養心筋細胞の系を構築し、化合物の効果を判定する。
３）HFpEFモデルやHCMモデルマウスを導入または作製して効果を判定する。
４）化合物との共結晶化条件を検討し、共結晶構造を取得する。それにより化合物のさらなる合成展開に繋げる。
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Research Products
(3 results)
