2019 Fiscal Year Annual Research Report
流動性足場・曲面足場設計に基づくオルガノイドの精密誘導技術の開発
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18H04167
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
木戸秋 悟 九州大学, 先導物質化学研究所, 教授 (10336018)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | オルガノイド / 流動性足場 / 曲面足場 / メカノバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、細胞の三次元自己組織化を誘導する足場マトリックスの力学物性・形状特性の設計により、 オルガノイドを再現よく精密・高効率に作製する学理と技術の確立を目的とする。いかなる培養力学場および足場形状がオルガノイド形成に対する最適条件を与えるか?本研究では研究代表者が独自に開発してきた培養環境力学場の設計技術に基づき、足場材料の流動性および曲面性の二問題の検証と応用に取り組む。
第二年度は、初年度に引き続き「流動性足場の粘弾性特性設計によるオルガノイド形成」について研究を継続するとともに、当初計画のとおり項目２「培養環境の曲面設計によるオルガノイド形成」に関する検討に着手した。まず、流動性足場の粘弾性特性条件がオルガノイド形成に与える影響の詳細な解析を昨年度までの結果をさらに拡張するかたちで推進した。従来用いられているマトリゲルのモデル系として多糖類としてジェランガムを用い、オルガノイドを発生させる際の第一事象となる間葉系幹細胞の三次元巻き上がり集合現象が、5kPaの貯蔵弾性率および力学的損失正接が0.088より小さい場合により効率的に生じることを見出した。オルガノイド形成のためには、足場ゲルの最表層が細胞集団の牽引力により降伏変形を起こし流動性を得ることが重要である一方、一定の足場強度を両立している必要のあることが示唆された。次に、足場の曲面特性がオルガノイド形成に与える影響を調べるための実験系として、まず曲率半径の連続的勾配を有するマイクロピペットガラス基材上での間葉系幹細胞の動態解析を行った。この結果、細胞は特定の曲率領域に集合しようとする傾向が認められ、オルガノイド誘導のための曲面足場の設計における留意点および指針としての知見が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、上記研究項目１および2について同時に検討を進めた。前者は昨年度の成果を踏まえて、再現よく安定にオルガノイド形成を誘導する足場材料の粘弾性特性のさらに精密な決定を目的とした。マトリゲルの代替材料候補としての多糖類ジェランガムゲルについて、原子間力顕微鏡を用いたミクロ動的粘弾性測定値と、オルガノイド形成の際の細胞集合のダイナミクスとの相関を系統的に解析した。オルガノイド発生の初期段階における細胞集合では、まず間葉系幹細胞などの細胞集合促進細胞（間葉凝縮を利用）が2次元基材上で網目状の細胞シート構造を形成したのち、そのシートが周囲からめくれ上がるようにしてミリスケールの巨大な細胞集合体を誘導する。この構造は内部に大きな空隙を有しているため、ミリスケールの集合体であっても内部は壊死せず、さらに血管内皮細胞や他の機能細胞と共培養するときの内部秩序構築に有利な特性を有する。ジェランガムゲルの最表層のミクロ粘弾性値として、貯蔵弾性率が5kPaおよび力学的損失正接が0.088より大きい条件では、この初期細胞集合体の構造が乱れて、まとまりに欠ける傾向が見出された。安定なオルガノイド形成のための足場粘弾性条件の有力な定量的指針の一部を得ることに成功した。
項目2についてはオルガノイドの最終立体形状の制御を最終目的とし、足場自体に生体類似曲面構造を導入する際の細胞集合挙動の操作指針を得ることをねらって、まずは曲率勾配を有する足場材上での細胞集合促進細胞の運動特性の把握から検討を開始した。先細りとなるように自作したマイクロピペットに間葉系幹細胞を播種し、そのピペット上での運動をタイムラプス観察により解析したところ、新たな接触走性とも考えられる曲率勾配依存的な指向性細胞運動が認められた。曲面足場上での細胞集合を操作する際の曲率設計の指針の一部を得ることができたものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度までに、安定したオルガノイド形成に必要となる足場粘弾性特の要件として、初期細胞集合を円滑に進行させるための足場弾性率値と流動性指標としてのlos tan値を見出し、さらに集合促進細胞の足場曲率依存的指向性運動の誘導条件の手がかりを得た。当初計画における流動性足場、曲面足場の両観点に対して、一定の定量的設計指針を得ているが、この条件下で異種細胞の機能的秩序を発現したオルガノイドを確実に発生させることができているかどうかについての詳細な検討が今後の中心的課題となる。さらに、曲面足場に関して得られた設計指針の具体的応用が興味深く、重要な課題となってくる。今後の研究の推進方策としては、まず、上手法・上原理にて生成した細胞集塊の詳細な特性解析を引き続き進める。三次元観察による血管構造の形成の確認、血管周囲細胞のマーカー発現、集塊中の間葉系幹細胞の分化・未分化特性の把握を行う。曲面足場における指向性細胞運動の活用については、凹型の曲面足場においてより細胞が効率的機能的に集合しやすい曲面の決定と、その曲面に対する表面粘弾性の付与を行う。流動性足場および曲面足場の融合によるオルガノイド形成技術の構築は当初計画の項目３にあたり、計画に従って今後の研究を遂行していく。
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