2020 Fiscal Year Annual Research Report
流動性足場・曲面足場設計に基づくオルガノイドの精密誘導技術の開発
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18H04167
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
木戸秋 悟 九州大学, 先導物質化学研究所, 教授 (10336018)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | オルガノイド / 流動性足場 / 局面足場 / メカノバイオロジー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、細胞の三次元自己組織化を誘導する足場マトリックスの力学物性・形状特性の設計により、 オルガノイドを再現よく精密・高効率に作製する学理と技術の確立を目的とする。いかなる培養力学場および足場形状がオルガノイド形成に対する最適条件を与えるか？本研究では研究代表者が独自に開発してきた培養環境力学場の設計技術に基づき、足場材料の流動性および曲面性の二問題の検証と応用に取り組む。
第三年度は、「流動性足場の粘弾性特性設計によるオルガノイド形成」について実際の肝オルガノイドの作製への適用を開始した。流動性足場の粘弾性特性条件がオルガノイド形成に与える影響について、従来から汎用されている生物由来材料であるマトリゲルをコントロールとし、マトリゲルの粘弾性自体を細胞毒性のほとんどない架橋試薬ゲニピンによる化学架橋の追加、および超音波処理によるマトリゲル成分・物理架橋の一部切断により調整した際の、iPS細胞による原始腸管スフェロイド形成後の肝オルガノイドの形成誘導効率を調べた。追加架橋および架橋切断のそれぞれの条件における動的粘弾性をレオメーターおよび原子間力顕微鏡を用いて測定し、オルガノイドの誘導効率との関係を解析した結果、オルガノイド形成を導く新規マトリックスの設計要件としてマトリゲルの原液よりやや高い弾性（100-150Pa）を有しつつ損失正接は0.4程度を持つことが必要であると分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
肝オルガノイドの安定形成に必要な足場粘弾性条件を特定するために粘弾性特性の異なるマトリゲル内にiPS細胞 から誘導した原始腸管スフェロイドを培養し肝オルガノイド形成の観察及び形態の比較を行った。コントロールマトリゲルに包埋したスフェロイドは培養と共に典型的な肝オルガノイドの成長を示したが、培養日数経過とともにプレート底面に沈降して構造が崩れ、プレート面上で接着分散してしまうものが4割ほど見られた。一方、 ゲニピン添加によって弾性成分を強めたマトリゲルではゲニピン濃度に依らず培養日数と共にスフェロイドの崩壊する様子が観察された。さらに15分間のソニケーションによって弾性成分を弱めたマトリゲルでは、内腔拡張しているスフェロイドも一部存在したものの、培養2日後の時点で半数以上のスフェロイドがプレート底面に沈降し、培養7日後時点で9割以上の細胞塊がプレート底面に接着分散している様子が観察され、マトリゲル原液条件よりも早い段階で細胞塊の沈降したことが確認された。マトリゲルの原液やソニケーションを施した条件ではスフェロイドの浮遊を保持するだけの弾性が無く、ゲニピン添加条件ではスフェロイドの浮遊は保持できるものの化学架橋による結合が強すぎてスフェロイドの内腔拡張を妨げてしまうため、オルガノイド形成を阻害していた。以上の結果からオルガノイドの安定形成のためには、スフェロイドの浮遊保持とともに、スフェロイドを構成する細胞の分化進行に伴う細胞運動を妨げないことを両立する粘弾性特性が必要であると分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度までに、iPS細胞からの腸管スフェロイド誘導および肝オルガノイドの発生に対するマトルゲルの粘弾性特性の影響を系統的に解析する実験系を確立した。粘弾性特性の評価には動的粘弾性測定装置および原子間力顕微鏡を用いた微視的動的粘弾性測定の両者を併用し、肝オルガノイドの誘導効率と環境粘弾性の定量的対応関係を解析可能としている。今後の研究の推進方策として、ここまでの確立した系に基づき当初計画のとおり、合成高分子を用いたマトリゲル代替流動性足場材料の構築に取り組む。マトリゲルの粘弾性調整検討から得られた最適マトリックスの損失正接0.4程度を実現するとともに、マトリゲルの主要な生理活性要素として重要となるラミニンの適切な導入を検討する。
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Research Products
(6 results)
