2018 Fiscal Year Annual Research Report
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18H05229
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
杉山 正明 京都大学, 複合原子力科学研究所, 教授 (10253395)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 洋 国立研究開発法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門 原子力科学研究所 物質科学研究センター, 研究副主幹 (20379598)
矢木 真穂 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 助教 (40608999)
佐藤 衛 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (60170784)
齋尾 智英 北海道大学, 理学研究院, 助教 (80740802)
苙口 友隆 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 講師 (90589821)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Keywords | ドメインライゲーション / 中性子準弾性散乱 / 中性子溶液散乱 / 蛋白質重水素化 / 租視化分子動力学計算 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
H30年度は研究計画に沿い「試料調製」に関しては「調製環境」「必要な測定機器の整備」「調製条件の検討・予備発現」、「中性子溶液散乱」に関しては「MurD・Hefを用いた測定条件確認のための試験中性子溶液散乱測定」、「計算機解析法」に関しては「計算機環境の整備」「ソフトウェア開発」「試験解析」を行った。以下、具体的に記載する。
【試料調製】MurDはドメインライゲーション法の確立を進めている。ライゲーションのためには変異導入が必要となるが、この変異導入によるダイナミクスの変化は起こらない事をNMRを用いて確認した。Hefはスプリットインテイン法を用いて3つのドメインライゲーションに成功した。これは世界的に見て非常に価値が高い成果である。Tr-Ubもユビキチン結合酵素を用いてドメインライゲーションに成功した。更に4つのドメインを持つPDIファミリー蛋白質のER-60の高純度精製に成功した。今後はこの蛋白質も研究対象に加える予定である。必要機器として質量分析器の導入を行い、既に重水素化蛋白質の重水素化率検定に利用している。
【中性子溶液散乱測定】J-PARCのBL02を用いて、MurDおよびHefの必要濃度・測定時間等の予備検討実験を行った。濃度50mg/mLの試料の場合、6時間程度で内部ダイナミクスが測定可能であることを確認した。この成果は論文に公表予定である。また、Hefはドメイン蛋白質であるMurDとは異なったIDP特有の運動が観測された。
【計算機】専用の計算環境確立のために機器導入を行い、免疫に関する蛋白質を用いたMD計算により動作確認を行った。更に今後の大きな蛋白質に対応するために租視化MD法の確立を進めている。
以上より、H30年度は今年度以降の研究に必要となる技術の確立・装置の導入を滞りなく進めた。また、それらを用いた予備実験の中から公表に値する成果も創出できた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度は研究の基礎技術の確立に研究を注力して進め、予定通りの成果(一部は予定以上)が得られている。「試料調製」では特に今後の基礎となる蛋白質におけるマルチドメインライゲーション技術の開発に注力した。ライゲーションには種々の手法が存在しており、ライゲーションを成功させ、中性子散乱が要求する大量発現を可能にするためには系に応じて最適な手法を選択する必要がある。また、ライゲーション自身が系の動的な性質に変化を与えていないかについても確認する手法の確立が必要である。本研究ではドメイン連結蛋白質とランダムコイルを仲介した蛋白質(天然変性蛋白質：IDP)と言った特徴的な構造を持つ4つの蛋白質を取り上げ、そのドメインライゲーションを進めている。現在ドメイン蛋白質では「MurD」がライゲーション手法の検討終了、「Tr-Ub」はライゲーション手法確立・大量発現開始、「ER-60」が高純度試料調製手法確立・ライゲーション手法の検討開始と言った状況であり、一方、IDPであるHefはライゲーション手法確立・大量発現準備段階である。Tr-Ubは2019年度前半、MurD・Hefは2019年度後半から2020年度前半にはライゲーション試料を用いた実験開始予定である。中性子準弾性散乱実験は、予備検討実験を既に開始し、解析に耐えうるデータの取得のための条件検討は終了している。しかしながら、測定時間・濃度の削減のための試料セルを改良は重要であると認識し、2019年度以降、セルの開発を研究課題に追加する。MDをはじめとする計算機手法開発に関しては装置導入・調整が終了し、実際の系での計算を開始段階まで進展した。更に租視化MDのための条件検討にも着手した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究の成功ためには「試料調製手法の開発」「中性子を初めとする溶液ダイナミクス測定手法の開発」「分子動力学計算による測定データ解析手法の開発」の各研究項目が綿密に連携して進めていく必要がある。そのため2018年度は代表・分担・連携の研究者全員が集合しての会議を２回、テーマを絞ったTV会議を２回、学会等での参加者のみの会議を２回行った。2019年度も同様に綿密な連携のもとに進めていく予定である。各研究テーマごとの研究推進方策を述べる。「試料調製手法の開発」では現在進めているドメインライゲーションの開発をより一層発展させ大量発現を目指し、更に重水素化技術とリンクさせることで、ヘテロドメイン重水素化試料の調製法の確立を行う。「中性子散乱手法」では準弾性散乱測定データの取得を進め、ドメインダイナミクスの測定技術の確立を進める。また、小角散乱では、SAXS・SANSさらに質量分析・超遠心分析・NMRとの連携測定を行い、MDと合わせたダイナミクス解析手法へと展開を進める。「計算機技術開発」では大型蛋白質や多分散平衡系の解析も見据えて租視化MDを進めるとともに、カスケードMD法の開発を進めていく。
問題点としては中性子準弾性散乱における必要試料量が多いことである。上述の通り各試料の大量発現法を目指すが、装置側からもJ-PARCの強度増強に合わせて、J-PARCの装置スタッフとともにより最適な試料量を検討する。さらに、現在使用している試料セルは主として固体試料や試料量に制限が少ない高分子用に開発されたものである。そこで、溶液散乱に最適化した試料セルの開発にも取り組む。
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Research Products
(3 results)
