2021 Fiscal Year Annual Research Report
Neutron Structural Biology for New Generation
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18H05229
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
杉山 正明 京都大学, 複合原子力科学研究所, 教授 (10253395)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中川 洋 国立研究開発法人日本原子力研究開発機構, 原子力科学研究部門 原子力科学研究所 物質科学研究センター, 研究主幹 (20379598)
矢木 真穂 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 助教 (40608999)
富永 大輝 一般財団法人総合科学研究機構(総合科学研究センター(総合科学研究室)及び中性子科学センター(研究開発, 中性子科学センター, 副主任研究員 (50513694)
佐藤 衛 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 客員教授 (60170784)
井上 倫太郎 京都大学, 複合原子力科学研究所, 准教授 (80563840)
齋尾 智英 徳島大学, 先端酵素学研究所, 教授 (80740802)
苙口 友隆 慶應義塾大学, 理工学部(矢上), 講師 (90589821)
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| Project Period (FY) |
2018-06-11 – 2023-03-31
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| Keywords | 階層関連ダイナミクス / 中性子溶液散乱 / タンパク質重水素化 / ドメインライゲーション / 計算機連携解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本課題では、蛋白質科学の未踏領域である時間領域ピコ秒―マイクロ秒、および空間スケールピコメータ－マイクロメータに存在する階層間連携ダイナミクスを明らかにするため、蛋白質の構造・ダイナミクスを可視化する試料・測定・解析の手法を開発し、実際の系に適応することで新たな生命科学を開拓することを目指している。
具体的には、ドメイン運動を可視化するのに適した【試料調製技術開発】、調製された試料の特長を生かした中性子散乱法と他の測定法を統合的に用いた【測定技術開発】、得られた測定データを計算機シミュレーションにより解析する【解析法開発】を行っている。
令和3年度は、コロナ禍の影響もあったが、感染対策に十分留意して大型施設（J-PARC等）の中性子散乱実験（準弾性散乱・小角散乱）を行った。その結果、様々な手法の統合解析によりHefのダイナミクスにおけるこれまで知られていなかった温度依存性などが得られている（論文執筆中）。また、昨年度同様に各研究グループの研究室内で実施できる研究を進展させるとともに論文発表も精力的に行った。以下の成果を簡潔に示す。【試料調製技術開発】ドメインライゲーション技術の開発を進め世界で初めて短リンカータンパク質での3ドメインライゲーションに成功した。更に蛋白質重水素化と組み合わせたドメイン塗分け試料の調製を開始した。【測定技術開発】これまでの予備実験を踏まえ測定条件等を精査し、かつ溶液散乱用に開発したセルを用いてJ-PARCにおいて準弾性散乱装置（DNA）を用いてHef及びER-60のドメインダイナミクスの本格的測定を開始した。【解析法開発】SEC-SAXS・SEC-iCM-SANS法と計算機モデリング・分子動力学シミュレーション法を統合した構造解析法を開発し、クライオ電顕でも完全に解明できなかった揺らぎを含む巨大タンパク質会合体の構造解明に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和３年度は、昨年度から続くコロナ禍は解消されはしなかったが、感染対策を十分に施すことで、いくつかの国内での実験は実施することができた。一方、海外施設を用いた実験では、現地に赴いて行う事は不可能であった。そこで、試料を送付し、現地スタッフとWeb会議システムを用いて測定前後に綿密な打ち合わせをすることで、ほぼ現地で行うのと同様な体制を構築して行った。これは今後の実験のスタイルの参考にもなると考えられる。また、昨年度と同様に各所属研究室で「所属施設での研究の充実」「TV会議を活用した研究会議の活性化」「成果の論文化」を進めることにより、これまで通りの研究レベルを維持できたと考えている。
酵素を用いたマルチドメインのライゲーションは、これまでは２つのドメインの連結をであったが、令和3年度では3つのドメインの連結を可能にするまでに進展した。同時にライゲーション反応を行う上で一番重要な条件検討項目である「最適なライゲーションサイト」を計算機シミュレーションにより予測する手法の開発も行った。これはライゲーション効率化・汎用化において重要な技術開発である、また、「Hefの内部運動の温度依存性の研究」では、J-PARCの中性子準弾性散乱（QENS）装置を用いた実験の精密化と同じく中性子小角散乱（SANS）装置を用いた実験も行い、QENSの結果を補強するデータが得られている。更に、NMR・CD測定MD計算も行い、統合的な解析を進めている。
以上より、コロナ禍の制限はあったが、国内施設を用いた実験・各所属実験室での研究を充実させ、外的制限を十分に補う進展があったといえる。よって、全体として「おおむね順調に進展している」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究ターゲットタンパク質であるHef, Tri-Ub, MurD, ER60の試料調製技術の開発（蛋白質制御重水素化法・マルチドメインライゲーション法・大量調製法）は、予定通り進行しており、ドメイン毎に重水素化率を変えた「ドメイン塗分けマルチドメインタンパク質」の作成が可能な段階まで来ている。今年度はこの手法を用いてと散乱実験時に十分な品質・量を供給できる体制を整える。特に品質管理は重要であるので、キャピラリー電気泳動法・分析超遠心法・質量分析法・X線小角散乱法を用いて綿密検証する。溶液構造・ダイナミクス測定に関してはJ-PARCを用いた中性子準弾性散乱（QENS）測定は新規セル・測定条件検討も昨年度までに完了している。そこで、上述の試料を用いた種々の条件でのQENS測定を進め、ダイナミクス解析を進める。国内では昨年度に研究炉（JRR-3）が再起動している。そこで、これ（SANS-U）を用いた中性子小角散乱の実験体制を構築し、J-PARCの中性子小角散乱装置（BL-15:TAIKAN）も合わせて利用し、より一層の研究を進める。解析手法はこれまで通り苙口グループによる全原子分子動力学法にベイズ統計を用いた統合解析手法が進んでおり、実験チームより供給するデータを用いて解析手法の検証・精密化を進める。更に杉山グループでの粗視化分子動力学法を用いた新たなダイナミクス解析手法（SAS-Clip）の開発も併せて進める。
また、これまで通り研究成果の学会発表・論文発表に加え、シンポジウム・ワークショップの開催も積極的に進め、他手法（クライオ電顕・NMR・結晶構造解析）との連携も行う。
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[Presentation] X線小角散乱と計算科学を用いた統合的解析による天然変性タンパク質の動的構造と機能の理解2022
Author(s)
小田 隆, 大井里香, 古寺哲幸, 安藤敏夫, 小沼 剛, 菅瀬謙治, 苙口友隆, 井上倫太郎, 杉山正明, 石野園子, 石野良純, 佐藤 衛
Organizer
日本農芸化学会2022年度京都大会(JSBBA2022)
Invited
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[Presentation] Subunit dynamics in alpha-crystallin through deuteration-assisted small-angle neutron scatterin2021
Author(s)
Inoue, Rintaro; Sakamaki, Yusuke; Takata, Takumi; Morishima, Ken; Wood, Kathleen; Sato, Nobuhiro; Okuda, Aya; Shimizu, Masahiro; Urade, Reiko; Fujii, Noriko; Sugiyama, Masaaki
Organizer
IUCr 2021
Int'l Joint Research
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