2018 Fiscal Year Annual Research Report
Identification and analysis of novel signaling molecules regulating AM symbiotic pathway via D14 family genes
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18J00182
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
亀岡 啓 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 特別研究員(PD)
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2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | アーバスキュラー菌根共生 / カリキン / ストリゴラクトン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究はD14L/KAI2経路ではたらく新規AM菌共生制御シグナル分子の単離を目標とする。D14L/KAI2経路依存的な遺伝子の発現誘導を指標に植物体や菌体の抽出物を精製することでD14L/KAI2経路により信号伝達される未知の植物ホルモンとAM菌由来シグナル分子を同定する。さらに、生化学的手法やトランスクリプトーム解析によって機能解析を行う。
本年度は①シグナル分子単離のためのアッセイ系の確立と精製 ②D14l2a, D14l2bの機能解析 に加えて、①が困難だった場合のバックアッププランとして③D14L/KAI2経路ではたらく転写因子のスクリーニングを計画していたが、①が順調に進行したため、①と②の実験のみ行った。
①当初はD14L2aのプロモーターを用いたレポーター系統(pD14L2a::YFP)を利用してアッセイ系を構築する計画だったが、化合物処理に適した若い植物体だとD14L2aの発現誘導が弱かったため、この系統はアッセイに用いることができなかった。そこで、D14L2bの発現量をqPCRで定量することで処理したサンプルを評価するアッセイ系を確立した。この系によって、AM菌菌体と植物体のそれぞれから目的のシグナル分子の活性を検出することに成功した。さらに植物体からの抽出物の精製を進め、シグナル分子の単離条件をほぼ確定することができた。
②d14l2a d14l2b二重変異体を作製し、野生型植物、d14l変異体、d3変異体と共にAM菌接種実験を行うことで、AM菌共生初期応答におけるD14l2a, D14l2bの機能を解析した。d14l変異体、d3変異体ではAM菌共生が著しく阻害されたのに対し、d14l2a d14l2b二重変異体は野生型と同程度の感染率を示したことから、D14l2a, D14l2bはAM菌共生に必須でないことが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究はD14L/KAI2経路ではたらく新規AM菌共生制御シグナル分子の単離を目的としている。本年度はシグナル分子単離のためのアッセイ系の確立し精製を進めることを第一の目標とし、バックアッププランとして同経路ではたらく転写因子のスクリーニング系確立を計画していた。また、変異体を用いたD14l2a, D14l2bの機能解析も予定していた。
シグナル分子単離のためのアッセイ系の確立に成功し、精製を勧めた結果、シグナル分子の精製条件をほぼ確定することができた。この実験系が順調に進んだため、転写因子のスクリーニングは行わなかった。また、d14l2a d14l2b二重変異体の解析からD14l2a, D14l2bはAM菌共生初期応答に必須でないことを明らかにした。
以上の結果から、本年度は期待通りに研究が進展したと判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初はシグナル分子の同定が困難だった場合のバックアッププランとして、酵母1ハイブリッド法による転写因子のスクリーニングを予定していたが、シグナル分子の精製が順調に進んでいるため、こちらの実験に注力する。
昨年度までにシグナル分子の精製法をほぼ確立することができた。本年度はまず精製法を最終的に確定する。また、昨年度から引き続き、ソースとなる植物体・菌体を大量培養する。構造決定に必要な量のシグナル分子を精製し、NMR,、MS解析によって構造を決定する。構造が決定できた場合、まずDFS法によってシグナル分子とD14Lタンパク質の相互作用を解析する。次に、RNA-seq解析によってシグナル分子の機能を解析する。
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