4D Imaging-based Analysis of Segregation Errors of individually labeled Chromosomes in Mouse Oocytes

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18J01017
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 竹之内 修 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(PD)
• Project Period (FY): 2018-04-25 – 2021-03-31
• Keywords: 減数分裂 / 染色体分配 / 卵母細胞 / CRISPR / DNA標識 / ライブイメージング / 光遺伝学 / 分子プローブ

Outline of Annual Research Achievements

卵母細胞は減数分裂によって染色体を均等に分配するが、分配が適切に行われないと卵母細胞内の染色体の数に異常が生じ、流産や先天的疾患につながることが知られている。さらに、これまでの不妊研究により、ヒトの卵母細胞内の個々の染色体は分配異常を起こす頻度が異なることが指摘されている。上記の報告は、染色体ごとに異なる制御メカニズムによって減数分裂が制御されている可能性を示唆する。しかし、既存の染色体分配に関する研究では、全ての染色体は同様の制御を受けるものとして実験・解析が進められてきた。そこで本研究では、マウス卵母細胞内の個々の染色体を個別標識し、減数分裂における動的挙動を解析することで、分配異常の頻度に差が生じる原因を明確にする。本検討の課題として、既存の染色体標識技術は細胞を固定する必要があるため、生きた卵母細胞内の染色体の解析が困難である点が挙げられる。したがって、生きた卵母細胞に応用可能な染色体標識技術を新たに構築する必要がある。
初年度の目標は、①既存の染色体識別法を用いて、固定した卵母細胞内の個々の染色体の空間的配置を把握すること、②生きた卵母細胞に応用可能な染色体識別分子プローブを開発することである。検証の結果、卵母細胞の分裂期の染色体は、特有の配置パターンを有することが判明した。さらに、CRISPR/Cas9 systemを応用することで生きた卵母細胞内の染色体を識別する技術の開発に成功したことを報告する。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

既存の染色体標識技術としてFluorescent in situ hybridization assay (FISH法)があげられる。しかし、通常のFISH法では、細胞を破砕して染色体観察する方法が主流であり、卵母細胞の内部構造を維持したまま染色体を観察する汎用的手法は確立されていない。またFISH法では、液体窒素によって細胞膜の浸透性を向上させる処理が知られているが、実際には卵母細胞が破裂もしくは紛失し、十分なサンプル数の確保が困難であった。そこで、本検討では、卵母細胞の免疫染色法のプロトコールを参考にして細胞膜の透過処理を長時間行った。結果、卵母細胞を失うことなく内部構造を維持したままFISHによる染色体標識が可能となった。そこで、減数第一分裂期における複数種の染色体の局在を検証した結果、染色体の物理的要因が局在に影響することが判明した。この結果は、減数第一分裂期において、各染色体で微小管の接合の起こりやすさが異なる可能性を示唆している。つまり、微小管との接合様式が染色体挙動や分配に影響している可能性が考えられる。
次に、生きた卵母細胞内の染色体を標識する技術の開発を行った。まず、マウスのゲノム情報を用いて、各染色体の染色に適した配列を選定した。次に、ゲノム編集に汎用されているCRISPR/Cas9を用いたDNA標識技術を用いて、選定した配列のイメージングを行った。結果、卵母細胞内の2種の染色体特異的な配列に起因する蛍光シグナルを観察することができた。さらに、用いる蛍光タンパク質の種類や数を最適化することで、蛍光シグナルを長時間安定して追跡することが可能だと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

これまで2種の染色体の標識に成功したため、今後は残りの染色体に関してイメージングに適した配列を選定し、CRISPRによる標識を試みる。用いる蛍光タンパク質や染色体への結合数の違いを基に、卵母細胞内の20種の染色体の同時検出を行い、減数分裂における各染色体の動的挙動の相違点を明確化する。
初年度の検討により、微小管の接合のタイミングや接合の方式が染色体の動的挙動に影響する可能性が示唆された。そこで、微小管接合を阻害する薬剤処理により、各染色体の局在がどのように変化するか検証する。また、微小管の接合を任意のタイミングで可逆的に制御可能な光遺伝学ツールを作製し、微小管接合のタイミングに関する検証を行う。さらに、卵母細胞内の局在の違いによって、染色体にかかる張力が異なるか検証を行う。以上の検討により、微小管の接合を通じて染色体にかかる張力に差が生じ、染色体分配のエラー頻度に差が生じる可能性が検証される。また、老化したマウスでは染色体分配のエラーの頻度が上昇することが知られているため、各染色体の動的挙動の変化をライブイメージングによって検証を行う。