2018 Fiscal Year Annual Research Report
膜翅目昆虫カブラハバチの性決定関連遺伝子の同定とその機能解析
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18J13188
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
峰 翔太郎 東京大学, 新領域創成科学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2020-03-31
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| Keywords | 性決定 / 膜翅目 / doublesex / 性分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
カブラハバチゲノムからdsxオルソログを同定した：セイヨウミツバチの性決定関連遺伝子である、Csd、Fem、Amdsxのオルソログの同定を試みたところ、CsdやAmfemに相当するものは発見されなかったが、Amdsxと高い相同性を示す予測遺伝子を発見することができた。この予測遺伝子は、他のあらゆる昆虫のdsxとも高い相同性を示したことから、この遺伝子をカブラハバチのdsxとみなし、Athalia rosae doublesex (Ardsx) と呼ぶことにした。
Ardsxは雌雄で異なる発現パターンを示すことを突き止めた：RACE法を用いてArdsxの全長cDNA配列を決定した。その結果、Ardsxは雌雄それぞれに特有のsplice variantを生じることがわかった。Ardsxの発現量の経時的推移をqRT-PCRにより定量した結果、Ardsxの発現は、孵化6日後以降の雌雄で共に高く発現していることが明らかになった。
Ardsxは雄分化に必要な機能をもつことを明らかにした：Ardsxの機能解析を行うためにdsRNAを用いたノックダウン（KD）を行った。ArdsxKD雄の外部生殖器には雌特有の器官である産卵管とそれを覆う鞘状の構造が見られた。一方ArdsxKD雌の外部生殖器には変化がみられなかった。内部生殖器に関してはArdsxKD雄の精巣に顕著な萎縮が見られた。ArdsxKD雄の交尾行動についての解析を行ったところ、コントロール雄と同じく交尾を試みるが、成功する個体はみられなかった。このことから、Ardsxのノックダウンは交尾行動へ影響を与えることなく、外部生殖器に変異をもたらすため、交尾障害を引き起こすということが明らかになった。以上の結果から、Ardsxはカブラハバチの雄分化にとって重要な機能をもつといえる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以前のRNAi実験では終齢幼虫に注射を行い遺伝子の機能解析を行なっていたが、カブラハバチは前の世代の雌の蛹にdsRNAを注射することで、dsRNAを卵に取り込ませることが可能である。これにより胚発生初期から成虫まで一貫してArdsxの発現をRNAiによりノックダウンしたところ、雄の内部生殖器は卵巣へ分化することがわかった。以上の結果から、Ardsxはカブラハバチの雄分化に必要であることが判明した。一方、同様のRNAiを雌に施したが、性分化に異常はみられなかった。以上の結果は、Ardsxが雌分化において機能をもたないこと、またカブラハバチの雌分化がデフォルトで起こることを強く示唆している。
またArdsxのノックダウンにより卵巣を形成した雄の卵は、その雄が半数体であれば胚発生能を持たないが、2倍体雄であれば完全な胚発生能を持つことが明らかとなった。
以上の結果から、卵の胚発生能には倍数性が重要であることが判明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
RADシーケンスによる相補性性決定機構の責任遺伝子の同定
カブラハバチの性はセイヨウミツバチと同じ相補性性決定機構により決まることが知られている。従って、相補性性決定機構の責任遺伝子は、雌で常にヘテロ接合、雄で常にホモもしくはヘミ接合となる。このような条件に当てはまる遺伝子をゲノムワイドに探索する手法として近年RADシーケンス法が用いられている。そこで本研究においてもRADシーケンスを行い、その結果得られたSNPs情報に基づいて上述の条件に当てはまる遺伝子を探索する。通常カブラハバチでは未受精卵から産まれる半数体が雄となるため、RADシーケンス用のサンプルとして２倍体雄を多量に得る工夫が必要となる。本実験では、母親―息子間交配を行うことでこれを実現させる予定である。また、雄が確実に２倍体であることを確認するためには未受精卵か受精卵かを判別する必要があり、そのために眼色や脂肪体色の変異遺伝子をマーカーとして用いる。
性決定時期の特定とその時期に性特異的に発現する遺伝子の網羅的探索
カブラハバチの性決定時期は不明である。性決定のマスター遺伝子は性決定時期に特異的に発現するという特性をもつため、性決定時期において特異的に発現する遺伝子を網羅的に解析することは、性決定のマスター遺伝子を捉える上で重要な手掛かりとなる。そこで、これまでに同定されたArdsxの胚子期における詳細な発現解析を行い、発生のどの段階で性が決まるか特定する。それができたなら、その時期の胚子をサンプリングし、RNA-seq解析を行う。得られたデータに基づき、性決定時期に特に高発現する遺伝子、性決定時期における発現量に顕著な雌雄差が見られる遺伝子を網羅的に同定する。上記のRADシーケンスにより候補として同定された遺伝子が、これらの遺伝子プールの中に存在するか確認することで、更なる候補遺伝子の絞り込みを行う。
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