2019 Fiscal Year Annual Research Report
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18J20102
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
江村 菜津子 岩手大学, 連合農学研究科, 特別研究員(DC1)
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2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 家畜 / 初期胚 / 組織分化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、ブタ胚の組織分化における分子基盤の解明を目的に、TEAD4-YAP1複合体形成阻害剤(Verteporfin; VP)の添加実験とPARD6B発現抑制実験の2種類の実験を行った。哺乳動物胚は桑実期から胚盤胞(BC)期にかけて内部細胞塊(ICM)と栄養膜細胞(TE)の組織分化を生じる。マウス桑実期胚の外側細胞では、Tead4-Yap1複合体がTE分化に必須であるCdx2やGata3発現を促進する。内側細胞ではHippo pathwayによってこの複合体形成が阻害され、ICMマーカーであるOct-4やSox2が優位に発現する。一方、ブタ胚では昨年度の研究で、VPの培地への添加が桑実期と拡張胚盤胞期への発生を阻害することを明らかにした。本年度はTEAD4-YAP1複合体の下流因子の同定を試みた。また、マウス胚では外側細胞において、aPKC-Par複合体による細胞極性がHippo pathwayを抑制しているが、ブタ胚の細胞極性に関する知見はない。そこで、ブタ胚の細胞極性における役割の解明を目指し、細胞極性関連因子であるPARD6Bの発現動態解析とRNA干渉法を用いた機能解析を行った。
桑実期形成前もしくは後のVP添加において、両方の場合で組織分化関連因子(OCT-4、SOX2、TEAD4)発現に変化はなかった。桑実期形成後のVP添加におけるCDX2およびGATA3発現量は無添加区と比較して有意に減少した。このことからブタ胚でもTEAD4-YAP1複合体がCDX2やGATA3発現を介してTE分化に寄与していることが示唆された。PARD6B mRNA発現は、卵子から8-16-細胞期まで高い値を示し、桑実期にかけて低下した。タンパク質は8細胞期から胚輪郭での発現が観察された。発現抑制実験では、BC期への発生が顕著に阻害されたが、組織分化関連因子発現に影響は認められなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、TEAD4-YAP1複合体の下流因子の同定を目的に、組織分化関連因子であるOCT-4、SOX2、TEAD4、CDX2およびGATA3発現をTEAD4-YAP1複合体形成阻害剤であるVerteporfin(VP)の培地への添加区と無添加区で比較解析した。その結果、ブタ胚においてTEAD4-YAP1複合体はCDX2やGATA3発現の促進を介してTE分化に寄与している可能性が示された。また、ブタ胚における細胞極性の役割を解明することを目的に、細胞極性関連因子であるPARD6Bの発現動態の解析に加え、RNA干渉法を用いた発現抑制実験を行った。本研究の遂行から、ブタ胚では8-細胞期頃から細胞極性が生じることが明らかになった。PARD6B発現抑制実験では、組織分化関連因子発現に影響は認められなかったものの、細胞極性はBC期胚形成に必須であることが明らかとなった。
これらの研究成果を基に、本年度はTEAD4発現抑制がブタ胚の発生および遺伝子発現におよぼす影響に関する論文と併せて、YAP1およびLATS2がブタの胚発生に必須であることを示した論文を国際学術雑誌に掲載した。また、昨年度と本年度で得られた研究成果を米国で行われた国際学会および国内の学会で発表している。
上記のように、本年度は、研究計画に従って実験を遂行しており、さらに研究成果の公表も行っていることから、「おおむね順調に進展している。」と評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究から、ブタ胚においても細胞極性がBC期への発生に重要であることが示されたが、未だ組織分化との関連性は明らかになっていない。マウス胚では、桑実期の外側細胞で生じた細胞極性がHippo pathwayを抑制することで、Yap1の核内移行を促進し、TE分化に貢献している。具体的には、Hippo pathwayが機能するには、細胞質でのAmotによるLatsの活性化が重要であり、外側細胞ではAmotが細胞極性関連因子により頂端側にトラップされるためLatsへの作用が妨げられる。このようにマウス胚ではAmotが細胞極性とHippo pathwayの関係性に関与している。これまでの研究からブタ胚においてもHippo pathwayが胚発生および組織分化に重要である可能性が示されてきたが、細胞極性との関連性は不明である上、AMOTに関する知見も一切ない。そこで今後は細胞極性とHippo pathwayの関係およびAMOTのブタ胚における役割を明らかにしていく。
細胞極性とHippo pathwayの関連性はRNA干渉法によりPARD6B発現抑制胚を作出し、その胚でのHippo pathway関連因子(YAP1およびLATS2)のmRNA発現をRT-リアルタイムPCRによって解析することで検討する。さらに、PARD6B発現抑制胚におけるYAP1の核内移行をYAP1抗体を用いた蛍光免疫染色法で解析する。
AMOTにおける実験ではまず、AMOT mRNAの各発生ステージでの発現量をRT-リアルタイムPCRで解析する。続いて、RNA干渉法によりAMOT発現抑制胚を作出し、その発生能と組織分化関連因子(OCT-4およびSOX2)発現におよぼす影響について検討する。
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Research Products
(6 results)
