2018 Fiscal Year Annual Research Report
植物の生理活性物質トレハロース6-リン酸を量的制御する酵素群の活性調節機構の解明
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18J20503
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田口 陽大 北海道大学, 農学院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | トレハロース６-リン酸 / トレハロースリン酸シンターゼ / トレハラーゼ / トレハロース / トレハロースホスファターゼ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
トレハロースは二分子のグルコースがα1-α1結合した非還元性二糖である．一般にトレハロースの合成はトレハロース6-リン酸（α-D-Glcp-(1-1)-α-D-Glcp6P）が合成された後，トレハロース6-リン酸のリン酸基が外される二段階の反応を経る．トレハロース6-リン酸は植物の発生や環境応答に対する生理活性物質として働き，トレハロース6-リン酸量の変化は微量であっても植物の生育に影響を与える．トレハロースの分解はトレハラーゼにより行われる．高等植物ではトレハロース6-リン酸の合成・脱リン酸酵素のアイソザイムを複数持ち，トレハロース6-リン酸やトレハロース量は，複雑・高度に制御されると考えられる．本研究では植物においてトレハロース6-リン酸やトレハロース量を調節するトレハロース代謝酵素の生化学的性質を明らかにすることを目的とした．
本研究の遂行にあたり，トレハロース6-リン酸が必要となるが，希少であり使用量に限度があることが問題であった．これまでにトレハロース6-リン酸の簡便な大量合成系を確立した．マルトースと無機リン酸のみを材料とし，3酵素と混合するだけのワンポット反応であり実用化に非常に適した手法である．これにより，従来行えなかったトレハロース6-リン酸を固定化したカラムの作成が可能となった．
トレハロースを加水分解する酵素であるトレハラーゼの研究では，Arabidopsisの酵素（組換え酵素）がトレハロース6-リン酸の加水分解を触媒する事，ならびに触媒時に触媒部位の溶媒から遮蔽の有無により2状態をとる可能性を見出し，これを追求している所である．単純な単量体酵素ながら部分構造の状態に依存して生理活性物質トレハロース6-リン酸の分解活性が増減するという生化学的に非常に興味が持たれる現象の発見と解析である．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
トレハロース6-リン酸の合成・脱リン酸酵素群は，複合体を形成し，活性調節が行われると考えている．この仮説を確かめるため，植物中の酵素を分離する必要がある．しかしながらこれら酵素の分離が難しいことが問題であった．我々は分離のために合成したトレハロース6-リン酸を固定化したカラムを用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーを検討した．このカラムを作製し，シロイヌナズナから抽出した粗タンパク質溶液よりトレハロース6-リン酸と相互作用するタンパク質の分離を行なった．分離したタンパク質溶液をSDS-PAGEにより解析すると，コントロールと比較してトレハロース6-リン酸を固定化したカラムでは特異的なバンドが確認された．トレハロース6-リン酸と相互作用するタンパク質の分離への利用が期待され，計画通りの進行具合である．
またトレハラーゼについては大腸菌を用いて作製したシロイヌナズナのトレハラーゼの組換え酵素の解析を行ってきた．これまでに，トレハロースを分解する酵素と考えられてきたトレハラーゼが，微弱ながらもトレハロース6-リン酸を分解する知見を見出している．シロイヌナズナのトレハラーゼは，トレハロースに対して各pHで反応速度を測定すると，酸性域と中性域にピークを示し，酸性域における活性が高かった（現在解析されている他のトレハラーゼではピークは1つしか確認されない）．また，このトレハラーゼはpHに依存して基質特異性が大きく変化した．以上より本酵素はpHに依存して少なくとも2つの状態の酵素基質複合体を持つことが予想された．トレハロース6-リン酸はこの2つの状態のうち，酸性域における状態でよく分解される．この状態は他のトレハラーゼでは確認されず，この酸性域における状態に寄与する構造を明らかにしたい．
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| Strategy for Future Research Activity |
トレハロース6-リン酸の合成・脱リン酸酵素群が複合体を形成し活性調節が行われるという仮説を検討するため，先に説明したトレハロース6-リン酸固定化カラムを用いて，植物トレハロース代謝酵素の分離が行えないか検討する予定である．分離が不可能の場合は他の方法を検討し，植物中でのトレハロース代謝酵素の状態を観測したい．また，トレハロース6-リン酸固定化カラムによって植物中から分離されたタンパク質についてタンパク質同定を行い，機能未知タンパク質であった場合はこれに注目した解析を行いたいと考えている．
植物トレハラーゼの研究について，これまでに明らかとなった性質についてその原因となる構造について明らかにする予定である．構造と性質が既知の他のトレハラーゼとの配列比較を行い，いくつかのアミノ酸残基が，酸性域における状態に寄与すると予測された．該当残基の変異酵素を作製し，速度論的解析を行っている．解析した変異酵素のうち，ある変異酵素では2つのpHピークが消失し，トレハロース6-リン酸への反応性が低下したものがあった．このアミノ酸残基は基質と直接相互作用するものではなく，基質結合部位を覆うループ構造の根元に位置するアミノ酸残基であった．この変異酵素ではトレハロース6-リン酸への反応性が低下したことより，より狭い基質結合部位を持つことが考えられる．このアミノ酸残基の変異によりループの動き方が変化し，2つの状態を取らなくなったかもしれない．今後AtTRE1のループ構造に着目し研究を進める予定である．
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