2019 Fiscal Year Annual Research Report
プロテオミクス／ゲノミクススクリーニング法を用いたＳＡＭＤ９分子機構の解明
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18J21048
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
中尾 佳奈子 東北大学, 医学系研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | 上流調節因子の同定 / 患者由来細胞を用いたゲノミクス解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は、同一検体からトランスクリプトーム解析（3’末端RNAシーケンス解析）とプロテオーム解析（LC-MS/MS解析）の両方を行うマルチオミックス解析を行った。試料には、Doxycycline誘導性プロモータ制御下にN末端にEGFPとFLAGタグ、C末端にTagRFPを付加したSAMD9発現プラスミドベクターをHEK293細胞のゲノムに組み込んだSAMD9安定発現株を用いた。この細胞株をDoxycycline添加培地で培養しSAMD9タンパク質（野生型もしくは変異型）を発現させた。コントロールにはDoxycycline未添加の細胞株を用いた。野生型SAMD9または変異型SAMD9の過剰発現に伴い変動するmRNAおよびタンパク質を、Ingenuity Pathway Analysisを使って解析した。その結果、変異型SAMD9強制発現に伴い変動するパスウェイの上流調節因子としてNUPR1を同定した。
ゲノミクス解析では、患者由来皮膚線維芽細胞を網羅的ゲノム編集スクリーニング解析（GeCKO）v2の本実験に供することに成功した。患者および健常コントロール由来皮膚線維芽細胞にGeCKO v2 レンチウイルスライブラリを感染させ、ランダムに遺伝子が不活化された細胞集団を作製した。その細胞群を各2つに分けてtechnical duplicateとして培養を行い、経時的に細胞からゲノムDNAを抽出し、組み込まれたgRNA配列を次世代シーケンシングで読みだした。その結果、duplicate間でのばらつきが大きく、また患者由来皮膚線維芽細胞で経時的にエンリッチされることが予想されたSAMD9がエンリッチされないという問題点が判明した。原因として、強い増殖抑制障害を示す患者由来皮膚線維芽細胞の培養条件が十分に最適化しきれていなかったことが考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
プロテオミクススクリーニングでは、新たな取り組みとして、同一検体からトランスクリプトーム解析（3’末端RNAシーケンス解析）とプロテオーム解析（LC-MS/MS解析）の両方を行うマルチオミックス解析を行った。試料には昨年度までに発現条件の最適化を行ったMIRAGE症候群モデル293細胞を用いた。その結果、変異型SAMD9強制発現に伴い変動するパスウェイの上流調節因子のうち、トランスクリプトーム解析とプロテオーム解析で共通するものとしてNUPR1（別名P8）を同定することに成功した。またゲノミクス解析では、昨年度は培養することが困難であったMIRAGE症候群患者由来皮膚線維芽細胞の培養条件の改良に成功し、網羅的ゲノム編集スクリーニング解析（GeCKO）v2の本実験に供することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度行ったマルチオミックス解析で上流調節因子として同定されたNUPR1が変異型SAMD9と同様の効果を細胞に対して与えるかを検証する目的で、NUPR1安定発現HEK293細胞を作製し、細胞増殖能を指標とした評価を行ったが変異型SAMD9強制発現細胞でみられるような細胞増殖抑制は観察されなかった。NUPR1とSAMD9の関係については現時点で明確ではなく、今後さらに検討を行う予定である。
また、MIRAGE症候群患者由来皮膚線維芽細胞を網羅的ゲノム編集スクリーニング解析（Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening；GeCKO）v2の本実験に供することに成功したが、以下2点の問題点が判明した。第一に、technical duplicate間でのばらつきが大きく、実験系の信頼性が担保されなかった。第二に、患者由来皮膚線維芽細胞で経時的にエンリッチされてくることが予想されたSAMD9がエンリッチされていなかった。原因として、強い増殖抑制障害と接着障害を示す患者由来皮膚線維芽細胞の培養条件が十分に最適化しきれていなかったことが考えられる。顕微鏡による観察では、継代後に再接着して増殖できる細胞が播種した細胞に対して著しく少なかった。このため、「接着できるか否か」という偶然による効果が、挿入されたgRNAの生物学的効果以上に作用してしまい、想定と異なる結果になったと考えた。細胞の接着性を上げるためにコラーゲンコートディッシュを使用することや培地の最適化によって培養条件を改善し、再実験を試みたい。
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[Journal Article] MIRAGE syndrome caused by a novel missense variant (p.Ala1479Ser) in the SAMD9 gene.2020
Author(s)
Onuma S, Wada T, Araki R, Wada K, Tanase-Nakao K, Narumi S, Fukui M, Shoji Y, Etani Y, Ida S, Kawai M.
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Journal Title
Hum Genome Var.
Volume: 7
Pages: -
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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