2019 Fiscal Year Annual Research Report

海馬神経回路編成におけるミクログリアによるニューロン選別機構の解明

Research Project

Project/Area Number	18J21331
Research Institution	The University of Tokyo
Principal Investigator	亀井亮佑東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC1)
Project Period (FY)	2018-04-25 – 2021-03-31
Keywords	ミクログリア / 神経新生 / 遺伝子導入 / 海馬歯状回 / 二光子in vivoイメージング / 免疫組織染色 / ミクログリア急性除去 / 神経分化
Outline of Annual Research Achievements	新生ニューロンとミクログリアとの相互作用を観察するため、前年度に海馬歯状回in vivoイメージングシステムを構築したが、新生ニューロンを機能的・形態的に標識する手法を検討する必要があった。まず、神経幹細胞にCreERを発現するマウスを用い、アデノ随伴ウイルス（AAV）による遺伝子導入法を検討した。複数種のAAVを用いて、新生ニューロン特異的に遺伝子導入することに成功した。しかし、AAV感染により神経前駆細胞が減少してしまうことが判明した。また、短期的な標識効率は高いものの、長期的には導入遺伝子の発現量が低下することも明らかとなり、生理的・長期的な新生ニューロン標識には不向きであることが分かった。そこで、トランスジェニックマウスによる遺伝子導入を試みた。トリプルトランスジェニックマウスを作成し、同一個体内で赤色蛍光蛋白を新生ニューロンに、緑色蛍光蛋白をミクログリアに発現させることに成功し、海馬歯状回の組織切片で緑色のミクログリアが赤色の新生ニューロンを貪食する様子を捉えることができた。また、新生ニューロンの機能イメージングのため、細胞の生死を評価できる色素やカルシウム感受性蛍光色素などのニューロンへの導入を、in vitro・in vivoで検討し、一部の色素がin vivoでも機能することを明らかにした。これらの標識により、二種細胞のin vivo形態・機能イメージングを行う準備が整った。一方、ミクログリアに介入してその寄与を知るため、ジフテリアトキシン投与でミクログリアを高効率に除去する系を確立した。ミクログリア除去に伴い、新生ニューロンの分裂・生存・分化にどのような変化が生じるかについて、分裂細胞の標識や、分化マーカー、アポトーシスマーカーの免疫染色を行い、組織学的なデータの取得を終えた。この定量結果を踏まえて、より特異的な介入点を設定していく予定である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当該年度の研究目標は、①ウイルスベクターやトランスジェニックマウスによる新生ニューロン特異的な遺伝子導入法を検討し、新生ニューロンとミクログリアとの二種細胞同時in vivoイメージングや、カルシウムイメージングなどの機能的なイメージングを実現すること、②急性かつ一過性にミクログリアを除去した際に新生ニューロンの分裂・生存・分化にどのような変化が生じるかを明らかにすることでミクログリアの寄与を明らかにすること、の二点であった。その目標に照らし合わせると、①については、AAVによる遺伝子導入は不適切であったものの、トランスジェニックマウスによる遺伝子導入に成功し一定の成果を上げることができた。またin vivo機能イメージングに有用な色素を複数同定することができた。今後、前年度に確立したイメージング手法にこれらの標識法を組み合わせて、二種細胞相互作用の理解を深めていく必要がある。②については、ミクログリアを除去した際に、新生ニューロンの分裂・生存・分化にどのような変化が生じるかについて、免疫染色の手法を用いて組織学的に十分な量のデータを取得できたことは評価できる。
Strategy for Future Research Activity	本年度までの研究で、マウス海馬歯状回の二光子in vivoイメージング手法を確立し、新生ニューロンの形態的・機能的な標識をミクログリアの蛍光標識と同時に実現することも可能となった。これらの系を組み合わせて、実際に二種細胞の形態・機能in vivoイメージングを進め、二種細胞相互作用の理解を深めていく。イメージングで得られた情報をもとに、この相互作用に関与する遺伝子の同定も試みる。また、ミクログリア除去が新生ニューロンに与える影響について、本年度に得たデータの解析結果を踏まえて、より特異的な介入点を設定し、背後にあるメカニズムや生理的意義の解明を含めて、さらに詳細にミクログリアの役割を明らかにしていくことを目指す。