2018 Fiscal Year Annual Research Report
緩歩動物クマムシにおける求愛・交尾行動の初観測と性差をもたらす分子基盤の解明
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18J21345
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
杉浦 健太 慶應義塾大学, 理工学研究科, 特別研究員(DC1)
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2018-04-25 – 2021-03-31
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| Keywords | クマムシ / 生殖行動 / 性決定 / フェロモン / 発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
有性生殖を行うParamacrobiotus sp. TYO strainとMacrobiotus shonaicusにおける求愛・交尾行動を初めて観測し、日本動物学会の学会誌Zoological Scienceに投稿、2018年11月に受理された。また同内容でThe 14th International Symposium on Tardigradaで口頭発表を行い、The Carlsberg Foundationより授与される賞、Accommodation and Travel expensesを獲得した。本研究は自由放卵を行うクマムシにおける行動の先駆けであり、クマムシの発生や生殖研究を大きく発展させることができると期待できる。
我々のTYO、並びにM. shonaicusにおける求愛行動の観察と報告は、これらクマムシにオスを誘引するフェロモンが存在することを強く示唆した。そこでフェロモンの単離と構造決定のため、求愛行動中の行動を定量的に解析することでアッセイ系の確立を行った。メスのみを単離飼育した飼育水をオスに曝露することで歩行速度と首振り角に大きく差が見られた。またメス飼育水を分子量ごとに分け、オスの活性が最も顕著に表れた層を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により分画した。現在この分画における活性測定と質量分析(MS)による構造決定を並行して進行中である。
胚発生期における性決定遺伝子の発現変化を調べるため、約14日で孵化に至るTYOにおいて2日ごとにRNAを抽出、RT-PCRを行った。PrDmrt4は全てのサンプルで発現が見られなかった。一方でPrDmrt1は約25%のサンプルにて発現が見られ、TYOにおけるメス存在比(約30%)に近似していた。このことからPrDmrt1が初期発生段階からメス化誘導に強く関わっていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本年度の研究は、まず有性生殖系統のクマムシのオスとメスのトランスクリプトーム解析により性差のある遺伝子を単離することを目指していたが、計画通りに目的遺伝子を４個単離し、遺伝子発現部位を自ら改良したWhole mount in situ hybridization (WISH) 法により示すことに成功した。また、クマムシ発生過程でのRNAiによる遺伝子ノックダウン系についても独自の検討を進めている。
雌分泌フェロモンに関する研究についても、本年度の計画のメスのみを単離飼育した飼育水をオスに曝露し、オスの歩行速度と首振り角度によるアッセイ系を構築することにとどまらず、平成３１年度に計画していたこの活性画分を分取することにも成功した。
さらに、本計画では、求愛、交尾行動のみに焦点を当てていたが、その後の受精にも着目し、卵の超微細な形態的特徴や特殊な形態を持つクマムシの精子の運動能についても注目し、自らが筆頭となり共同研究を進めて、研究計画の拡充を進めている。
加えて現状までの成果を国際論文誌Zoological Scienceへ投稿、受理され、未だかつて報告されていないクマムシの生命現象を明らかにした。
上記より、本研究は期待以上の進展があったと言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究室で培養しているParamacrobiotus sp.とMacrobiotus shonaicusについて、雌雄別、また生殖様式別にトランスクリプトームを比較し、それぞれに発現量の偏りのある遺伝子群をピックアップする。これらのうち特に他の生物で発生・生殖に関連すると既知な遺伝子ホモログに関して、in situ hybridizationやRNAiを実施し、遺伝子機能の同定を行う。
Paramacrobiotus sp.とM. shonaicusの配偶子の形状、機能を比較し、進化的意義を明らかにする。特に雌性配偶子である卵と雄性配偶子である精子の形状は、受精に大きく関与すると考えられるため、産卵直後の卵を電子顕微鏡等を用いることで詳細に観察する。加えて精子の運動性にも着目し、遊泳する精子の運動を定量化する。またtubulin等を染色することで、精子の運動能をもたらす分子基盤を明らかにする。受精を必要とない近縁の単為生殖種の卵と比較することで、クマムシの受精能について考察する。また3倍体性を示す単為生殖種と、2倍体性の有性生殖種の初期発生を比較することで、倍数性の相違の意義を考察する。
2018年度に単離したParamacrobiotus sp.とM. shonaicusのメス飼育水をHPLCにより分画、各画分において再度オスでの活性を検討する。特に活性が認められた画分について、希釈系列を作成することで至適濃度を選定する。また当画分において質量分析を行うことで分子式の決定を行なう。加えてNMRを用いた詳細な構造決定を行う。
上記の成果をFertilization and Activation of Development, Gordon Research Conferenceや、各国内学会等で発表する。
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