2018 Fiscal Year Annual Research Report
Deep insight into metabolic lifestyle of nitrite-oxidizing bacteria
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18J22997
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Research Institution | Waseda University |
Principal Investigator |
石井 拳人 早稲田大学, 理工学術院, 特別研究員(DC1)
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Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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Keywords | 亜硝酸酸化細菌 / 硝化 / Nitrotoga / 分離培養 / ゲノム / 微生物間相互作用 |
Outline of Annual Research Achievements |
【亜硝酸酸化細菌Nitrotogaおよび共存細菌の分離培養】Nitrotogaは増殖速度が遅くコロニーを形成しないため,限界希釈法や平板培地法といった従来の方法では分離培養できない。そこでNitrotogaに適した培養方法を開発し,Nitrotoga sp. AM1を獲得した。具体的には,複数の抗菌薬を用いることで従属栄養細菌の菌種数を減少させた。また,アンモニアとピルビン酸を培地に添加し,Nitrotogaの増殖を促進させた。分離培養過程において,Acidovorax属に分類される細菌がNitrotogaの近傍に位置していることがわかった。Nitrotogaに近接するAcidovoraxは “生育因子” を受け渡している可能性がある。平板培地を用いることで共存細菌Acidovorax sp. NB1を分離培養した。 【分離株のゲノムシーケンス】Nitrotoga sp. AM1の完全ゲノムを構築した。AM1はこれまでのNOBとは系統が異なる亜硝酸酸化還元酵素を用いて亜硝酸酸化すること,カルビンベンソン回路で炭素固定することがわかった。またAM1ゲノムには,putative sugar transporterや解糖系/糖新生,TCA回路に必要な遺伝子群が保存されており,一部の有機物も代謝できる可能性が示唆された。Acidovorax sp. NB1に関しては,コンティグ数が60このドラフトゲノムを構築した。 【分離株同士の共培養実験】AM1単独培養系とAM1およびNB1の2菌種共培養系を用意した。共培養系の方が単独培養系よりも亜硝酸酸化速度が速く,AM1の世代時間が短くなる傾向があった。共培養系においてAM1の増殖速度が上昇したことは, NB1が産生する代謝物をAM1が栄養源として利用したことを示唆している。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は「亜硝酸酸化細菌Nitrotogaと共存細菌Acidovoraxの分離培養」と「獲得した分離株のゲノム解析」を完了させ,当初計画していた段階まで達成している。分離株を用いた生理活性試験では,異種細菌と共培養することでNitrotoga sp. AM1の増殖速度が高くなる傾向が観察されており,実験条件を改善することで有意差があるチャンピオンデータを取得できる見通しが立っている。「亜硝酸酸化細菌を異種細菌と共存させると,単独で培養した場合より細胞活性が高くなる」という現象が確認できたので,タンパク質発現レベルでも2群間に差異が見られることが予想される。プロテオーム解析を遂行するための技術的課題 (十分なタンパク質量の確保,質量分析器の解析条件の最適化) は残っているが,当初予定していた段階までは完了しているので上記の評価にした。
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Strategy for Future Research Activity |
【AM1とNB1の共培養】昨年度はAM1単独培養系とAM1-NB1共培養系の2群間でAM1の世代時間を比較した。AM1の増殖活性が上昇した理由として,1)共凝集体を形成しNB1がAM1に直接接触することで影響を与えた,2)培地中へ拡散したNB1由来の代謝物がAM1のへ作用した,の2点が考えられる。どちらの仮説が正しいかを確かめるため,代謝物は通すが細胞は行き来できない二槽式透析フラスコ(別府フラスコ)を用いた共培養系を用意する。単独培養系,共培養系,透析膜を隔てた共培養系でAM1の世代時間を比較する。 【共培養系の細胞内プロテオーム解析】NB1との共培養によってAM1が増殖速度の上昇する現象が確認された。単独培養系と共培養系における表現型の違いは,生命活動の根幹をなすタンパク質の発現量の違いを反映している。つまり,異なる条件でAM1を培養し網羅的にタンパク質の発現量を比較解析すれば,AM1細胞内で切り替わった代謝経路を理解できる。単独培養系,共培養系,透析膜を隔てた共培養系の3つの条件で培養したサンプルからタンパク質を抽出し,還元・アルキル化・トリプシン処理を施す。前処理したサンプルをLC-MS/MSへ供試し,断片化したペプチドを測定する。なお,最適なタンパク質抽出や前処理の条件,LC-MS/MSの運転条件は大量培養が容易なNB1を用いて検討する。
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Research Products
(3 results)