2019 Fiscal Year Annual Research Report
| Project/Area Number |
18J23340
|
|---|
| Research Institution | Nagoya University |
|---|
Principal Investigator |
鈴木 和人 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
|
| Keywords | バイオ触媒 / シトクロムP450 / 酸化反応 / 疑似基質 / 立体選択性制御 / 部位特異的変異導入 / シクロプロパン化反応 / 結晶構造解析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
シトクロムP450は、有機化合物中のC-H結合を水酸化する酵素群である。中でも、巨大菌から単離されたP450BM3は、天然基質である長鎖脂肪酸を極めて高速に水酸化することで知られる。その非常に強力な触媒特性から、有機化合物のC-H官能基化に向けたバイオ触媒としての応用研究が広く展開されているが、一方、P450BM3の脂肪酸に対する基質特異性は非常に高い。我々の研究室は、長鎖脂肪酸の化学構造を模倣した化合物「疑似基質」を開発し、これによりP450BM3の誤作動を誘起することで、ベンゼンやプロパンといった非天然基質の水酸化反応が可能になることを発見した。本申請課題では、この「疑似基質」の化学構造を利用して不斉酸化反応の立体選択性を制御することを目標とする。
当該年度に実施した研究では、P450の酸化活性種を模倣した人工金属錯体を置換したP450BM3と、「疑似基質」および非天然基質が同時に結合した結晶構造の解析に成功した。この構造から、「疑似基質」機構における、非天然基質の活性部位におけるダイナミクスを捉えることに成功し、反応機構の解明に大きく前進した。また、非天然反応であるシクロプロパン化反応では、2か所の変異を含むP450BM3と「疑似基質」を組み合わせることで、シス体生成物を優先的に得ることに成功した。この選択性は、進化分子工学により得られた14か所に変異を持つ多重変異体のそれと同等であり、「疑似基質」を利用する選択性制御法が、従来のタンパク質工学手法である変異導入に匹敵する強力な選択性変換ツールと成りうることを示した。分子動力学シミュレーションにより、「疑似基質」がこの高い選択性を引き出す機構の解明にも成功した。さらに、約6,000個の化合物ライブラリのバーチャルスクリーニングを行い、P450BM3に結合する可能性のある新規な構造モチーフを発見することができた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
以上の通り、「疑似基質」で制御する選択的な変換についてその機構解明につながる成果を得ており、当該研究は当初の計画以上に進展していると評価している。特に、結晶構造解析により基質のダイナミクスを捉えることに成功した成果に関しては、今後の触媒の設計に大きく貢献するものと考えている。「疑似基質」存在下において、触媒反応の各過程で非天然基質の向きが変化するという結果が得られたことから、反応の選択性が決定する段階を特定し、その構造を基に触媒を再設計することで、より選択性の高い系の開発が可能になる。このような、活性部位における基質の運動という現象はこれまでの研究例でもあまり報告例がなく、「疑似基質」を利用した系にとどまらず、P450による反応の研究に幅広く貢献する成果であると考えている。さらに、コンピュータシミュレーションの手法を多数駆使し、反応機構の解明や「疑似基質」の設計にも成功しており、これらの知見は今後の実験指針に繋がる、重要な結果である。特に、バーチャルスクリーニングによって新規な結合モチーフを特定できたことに関しては、これまである特定の分子群に構造が限定されてきた「疑似基質」設計の停滞感を打ち破る、ブレークスルーとなる可能性があるものと考えられる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
当該年度で特定した反応機構を基に、さらに選択性を大きく変化させる触媒系の開発に着手する。当該年度の研究から得られた結晶構造では、活性種の生成に伴って非天然基質が回転する現象が確認されており、活性種の生成後を想定した反応部位の再設計が今後の選択性の改善に不可欠となる。基質の回転を大きく誘起する「疑似基質」こそが選択性変化に有利であると考えられ、結晶構造解析を利用して、大きな回転を引き起こす「疑似基質」がP450BM3に与える影響の解明に着手する。基質の回転に重要な「疑似基質」の構造的特徴を抽出し、「疑似基質」の構造を最適化する。また、計算化学的な解析から得られる情報を駆使して、「疑似基質」とP450BM3の活性部位の再設計を行う。バーチャルスクリーニングより得られた新規構造モチーフは、これまでの「疑似基質」とは異なる構造的特性を有しており、従来の「疑似基質」とは異なる立体的な影響を活性部位に与えるものと推定される。このような未知の「疑似基質」候補は大量に存在すると考えられ、今後、バーチャルスクリーニングの範囲を拡大し、その探索を行う。さらに、それらの分子が結合した結晶構造を解析し、その構造に対してタンパク質モデリングソフトウェアや各種シミュレーションの手法を適用することで、より高選択的な反応を可能とする「疑似基質」およびP450BM3変異体の創出に取り組む。
|
