2018 Fiscal Year Annual Research Report
小分子RNAを介した胎仔期雄性生殖細胞におけるDNAメチル化機構の解明
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18J40010
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
北 加奈子 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(RPD)
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Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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Keywords | エピジェネティクス / de novo DNA メチル化 / レトロトランスポゾン / マウス精子形成 / PIWIファミリータンパク |
Outline of Annual Research Achievements |
胎仔期雄性生殖細胞におけるde novo DNAメチル化の分子機構を解明するために、PIWIファミリータンパク質の1つであるMIWI2と機能的関連を有するタンパクとして同定したMORC3(microrchidia 3)の胎仔期精巣での機能解析を行った。 まず、生殖細胞特異的Morc3コンディショナルノックアウトマウスを作製した。このコンディショナルノックアウトマウスの評価及び検証を行うために、この胎仔期精巣を採取し、PCR法を用いたジェノタイピング及び抗MORC3抗体を用いた免疫染色法により、精巣特異的にMORC3が発現していないことを確認した。 予備的実験において、レトロトランスポゾンであるLine-1の制御領域のDNAのメチル化が、Morc3 欠損マウスの生殖細胞において低下していることを、メチル化感受性制限酵素を用いたサザンブロット法により見いだしていることから、MORC3がレトロトランスポゾン領域のde novo DNAメチル化に何らかの役割を有していると考えられた。そこで、精巣におけるMORC3のDNAメチル化への影響を詳細に解析するために、野生型と、Morc3コンディショナルノックアウトマウスの精巣を採取し、バイサルファイトシークエンス法を用いてDNAのメチル化パターンを調べたところ、Line-1の制御領域のDNAメチル化が、Morc3コンディショナルノックアウトマウスの雄性生殖細胞において低下していることを見いだした。このことから、MORC3がLine-1制御領域におけるde novo DNAメチル化の獲得に重要な役割を果たしている可能性が高いと考えられた。同時に、各々の精巣からRNAを調整しノーザンブロット法を用いてレトロトランスポゾンの発現を解析したところ、Morc3コンディショナルノックアウトマウスの精巣においてLine-1の発現上昇が確認できた。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生殖細胞特異的Morc3コンディショナルノックアウトマウスの作製に成功し、そのマウスを用いた実験を計画的に進めている。初年度、Morc3コンディショナルノックアウトマウスの精巣において、レトロトランスポゾン領域、特にLINE-1領域のDNAメチル化の低下が認められ、更に、転写レベルにおいて、LINE-1の抑制が解除され、発現上昇していることが認められた。 つまり、MORC3は、胎仔期雄性生殖細胞において、レトロトランスポゾン領域、特にLINE-1のde novo DNAメチル化の獲得に大きな役割を果たしていることが示唆された。 更に次世代への影響として、交配テストを行った結果、Morc3コンディショナルノックアウト雄マウスでは、妊孕性が低い傾向が認められたことから、更に詳細に原因を解明したいと考えている。 以上のことから、順調に実験は遂行できており、次年度も引き続き実験計画に基づいて進めていきたいと考えている。
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Strategy for Future Research Activity |
次年度は、MORC3とpiRNAの関連を調べるために、胎仔期雄性生殖細胞を実験材料に、total RNAのシークエンスによるNGS解析を行う。更にMORC3のpiRNA経路への影響を詳しく調べる為に、MILI及びMIWI2に結合するpiRNA量及びpiRNAの種類をsmall RNAシークエンス法を用いて調べる。 また、胎仔期生殖細胞におけるde novo DNAメチル化機構に関わる新たな分子の探索を試みるために、Line-1の制御領域を認識し結合するZFタンパクを発現するTGマウスの胎仔期精巣を必要量採取し、実験準備を整えたことから、次年度には、この精巣から抗Flag抗体を用いて免疫沈降を行い、MIWI2の標的領域に結合するタンパクを質量分析により同定する。
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