2019 Fiscal Year Annual Research Report
小分子RNAを介した胎仔期雄性生殖細胞におけるDNAメチル化機構の解明
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18J40010
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Research Institution | Osaka University |
Principal Investigator |
北 加奈子 大阪大学, 医学系研究科, 特別研究員(RPD)
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Project Period (FY) |
2018-04-25 – 2021-03-31
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Keywords | エピジェネティクス / de novo DNA メチル化 / レトロトランスポゾン / マウス精子形成 / PIWIファミリータンパク |
Outline of Annual Research Achievements |
胎仔期雄性生殖細胞におけるde novo DNAメチル化の分子機構を解明するために、PIWIファミリータンパク質の1つであるMIWI2と機能的関連を有するタンパクとして同定したMORC3(microrchidia 3)の胎仔期精巣での機能解析を継続的に行っている。 MIWI2複合体を構成する種々のタンパクを欠損するマウスにおいて、piRNAの量、とりわけ、MIWI2に結合するpiRNAの量が野生型に比べて有意に低下していることが報告されている。そこで、生殖細胞特異的Morc3コンディショナルノックアウトマウスの胎仔期精巣においても、piRNA産生に影響があるかどうかをRNA sequence法を用いて調べた。野生型に比べてMorc3コンディショナルノックアウトマウスの胎仔期精巣では、piRNAの総産生量が半分程度に減少していることが明らかとなった。更に、先進ゲノム支援の協力のもと、野生型とMorc3コンディショナルノックアウトマウスの胎仔期精巣を実験材料に、抗MILI抗体及び抗MIWI2抗体を用いて、MILI及びMIWI2に結合しているpiRNAの種類及び量をsmall RNA sequence法を用いて調べた。その結果、Morc3コンディショナルノックアウトマウスでは、MILI及びMIWI2のどちらのタンパクにおいても、結合しているpiRNAの量が減少していること、また、それらのpiRNAにおいて、sense鎖とantisense鎖のどちらも同程度に減少していること、が明らかとなった。これらのことから、Morc3コンディショナルノックアウトマウスで認められるpiRNA産生量の低下、及びそれによるMILI及びMIWI2に結合するpiRNA量の減少が、胎仔期精巣におけるレトロトランスポゾン領域のde novo DNAのメチル化の低下に影響していることが示唆された。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生殖細胞特異的Morc3コンディショナルノックアウトマウスの作製に成功し、そのマウスを用いた実験を計画的に進めている。昨年度の研究成果から、MORC3は、胎仔期雄性生殖細胞において、レトロトランスポゾン領域、特にLINE-1のde novo DNAメチル化の獲得に大きな役割を果たしていることが示唆された。そこで、今年度は、MIWI2と機能的関係性を有するpiRNAとMORC3の関連を調べるために、胎仔期雄性生殖細胞を実験材料に、NGS解析を行った。その結果、Morc3コンディショナルノックアウトマウスでは、piRNA産生量の低下、及びそれによるMILI及びMIWI2に結合するpiRNA量の減少がみとめられた。これらのことから、胎仔期精巣において、MORC3はpiRNAの産生に関与し、レトロトランスポゾン領域のde novo DNAのメチル化へ影響を与えることが示唆された。 更に次世代への影響として、交配テスト、及び胚発生の観察を行った結果、Morc3コンディショナルノックアウト雄マウスでは、妊孕性の低下及び、次世代における胚発生率の低下の傾向が認められた。 また、胎仔期生殖細胞におけるde novo DNAメチル化機構に関わる新たな分子の探索を行うために、Line-1の制御領域を認識し結合するZFタンパクを発現するTGマウスの胎仔期精巣を必要量採取し、抗Flag抗体を用いて免疫沈降を行い、質量分析によりMIWI2の標的領域に結合するタンパクとして、CNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1)を同定した。 以上のことから、順調に実験は遂行できており、次年度も引き続き実験計画に基づいて進めていきたいと考えている。
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Strategy for Future Research Activity |
Morc3コンディショナルノックアウトマウスでは、piRNA産生量の低下、及びそれによるMILI及びMIWI2に結合するpiRNA量の減少がみとめられた。これらのことから、胎仔期精巣において、MORC3はpiRNAの産生に関与していることが示唆された。来年度は、このMORC3のpiRNA産生経路における作用機序、特に、MORC3のpiRNA前駆体の転写への影響を明らかにしたいと考えている。 また、胎仔期生殖細胞におけるde novo DNAメチル化機構に関わる分子の候補として、CNOT1(CCR4-NOT transcription complex subunit 1)を同定した。次年度は、CNOT1の生殖細胞における機能も解析していきたいと考えている。
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