Studies on the oxidative metabolic pathway for polysaccharides involving glycoside phosphorylases.

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 18K05387
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 仁平 高則 新潟大学, 農学部, 特任助教 (80615469)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ホスホリラーゼ / クローニング / タンパク質発現 / 基質特異性

Outline of Annual Research Achievements

澱粉やキチンなどの糖質の分解・代謝は，加水分解酵素の反応を中心に考えられてきたが，セルロース分解同様，酸化還元酵素による酸化的分解反応が関与する可能性が示唆されている。本研究では，この新規代謝経路の全貌を解明するために，酸化的分解の中間産物である酸性オリゴ糖を加リン酸分解する酵素ホスホリラーゼを，ゲノム情報やメタゲノムライブラリーを利用し網羅的に探索し，酵素学的，速度論的および構造学的特性の解明を目指す。
当年度は，（1）ゲノムライブラリーおよびメタゲノムライブラリーからのホスホリラーゼの探索，（2）ゲノム情報を基盤とした網羅的なホスホリラーゼの探索，（3）ホスホリラーゼホモログ遺伝子のクローニング，（4）ホモログタンパク質の発現・性質決定について，当初予定通り検討を加えた。その結果，ホスホリラーゼホモログ遺伝子を多く持つ微生物のゲノムDNAおよび環境中から回収したヘテロなゲノムDNAからホスホリラーゼホモログ遺伝子を獲得できた。また，ゲノム情報を基に網羅的にホスホリラーゼ遺伝子を探索・クローニングした結果，数種のホスホリラーゼホモログ遺伝子の取得に至った。得られたホスホリラーゼホモログ遺伝子を大腸菌に組み込み，タンパク質の発現確認を行なった結果，数種のホスホリラーゼホモログタンパク質を獲得した。それらタンパク質についてホスホリラーゼ活性を確認した結果，数種の新規ホスホリラーゼを発見できた。しかし，酸性オリゴ糖に作用する酵素については，既知酵素と基質特異性が若干異なる酵素が得られたものの，新規ホスホリラーゼの発見には至らなかった。