2020 Fiscal Year Annual Research Report
Development of screening tool for amino acid hydroxylase using insufficient TCA-cycle complementation test and its application
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18K05400
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
原 良太郎 京都大学, 農学研究科, 特定准教授 (70553535)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | Screening / Hydroxylase / Enzyme / Hydroxy amino acid / Dioxygenase / 3-Hydroxyhisitidine / 3-Hydroxyglutamine / Broken TCA cycle |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、産業上重要なヒドロキシアミノ酸の効率的生産を目指し、新規酵素の探索とプロセス開発を行った。まず、酵素探索に向け、TCA回路を担う2-オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼおよびイソクエン酸リアーゼの両遺伝子を欠損させた大腸菌株を造成した。これにより、本大腸菌ではTCA回路が不完全となるため、コハク酸が生成できずに最少培地では生育できなくなる。アミノ酸水酸化酵素は、2-オキソグルタル酸を共基質として利用し、コハク酸を生成する。ここで、アミノ酸水酸化活性を発現する株ではコハク酸が供給できるため、生育が可能となる。したがって、生育を指標とした活性型酵素のスクリーニングが可能となる。モデルとして用いたイソロイシン水酸化酵素遺伝子を発現する二重遺伝子欠損大腸菌は、L-イソロイシンを含むM9最少寒天培地上で生育した。
また、当該大腸菌はtrans-3-ヒドロキシ-L-プロリン生産にも有効であった。遺伝子欠損大腸菌は、共基質2-オキソグルタル酸の分解系が遮断されているため、生産プロセスにも有利であると予想した。実際に、プロリン水酸化活性を示すエクトイン水酸化酵素遺伝子を、遺伝子欠損大腸菌にて発現させ、菌体を触媒として用いた。その結果、2-オキソグルタル酸は分解されず、効率的にプロリン水酸化反応に供給された。
さらに、機能が不明であったタンパク質において、L-ヒスチジンおよびL-グルタミンを水酸化する新規酵素活性を検出した。晶析により生成物の単結晶を調製し、X-線結晶構造解析を行ったところ、水酸化産物の絶対構造はいずれもthreo-体であることが判明した。続いて、取得した酵素の諸性質を解析し、最適反応条件を決定した。これを踏まえ、酵素遺伝子を発現させた組換え大腸菌の菌体を触媒としたL-ヒスチジンおよびL-グルタミンの水酸化反応を行った。その結果、20 g/Lを超える生産性を示した。
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