2019 Fiscal Year Research-status Report
細胞内でのグアニン4重鎖構造形成の証明とその形成メカニズムの解析
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18K06072
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science |
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Principal Investigator |
加納 豊 公益財団法人東京都医学総合研究所, ゲノム医科学研究分野, 主席研究員 (90450593)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | G-quadruplex / Rif1 / in vivo |
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| Outline of Annual Research Achievements |
DNA上で様々な染色体機能を付与すると考えられる、通常の2本鎖DNAとは異なる構造を持つG-quadruplex DNA (G4DNA)にDNA複製の開始を抑制するRif1が結合することを分裂酵母で報告してきた。しかし、細胞内の染色体上でG4DNA構造がどのように形成され解消されるか等の情報は、殆ど報告されていない。それは、実際に細胞内でのG4DNAが構築されているか判断するツールがないのが主な原因と考えている。そこで細胞内のG4構造の検出方法の確立を本研究の目的とした。昨年度は、G4DNAのループにI-SceI切断配列を導入して、その切断部位に集積されるRad52-EGFPの観察でG4DNA構造の形成を判断できることを報告した。更に、G4DNA構造の形成に必要なG-tractに変異を入れG4DNA構造が形成されない株ではその切断効率が上昇することを新たに見出した。この方法を発展させ、I-SceI酵素により染色体の切断を誘導し、切断サイトへアダプターを融合させ定量LM-PCRで、切断効率からG4DNAの形成の有無の判定することに成功した。これらのデータとin vitroのデータを組み合わせて、現在論文を投稿中である。
また、細胞内で人為的にG4DNA構造を染色上に形成できないか、制御できるプロモーター下流にRif1の結合配列のG4DNAが形成しうる配列を導入して、分裂酵母に形質転換をして株を作成することを予定しており(現在進行中)、新たなG4の形成と解消の解析に利用できるツールの開発を模索する。加えて、G4DNAを解消するヘリカーゼ因子の分裂酵母の変異を導入することなどを行い、解消のメカニズの解析をすることにより研究課題を進展させる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで、in vivoでアイデアを模索し、in vitroで検証しつつ研究を進めてきたものがまとまり、論文投稿まで進行しているため、順調に進展していると考える。一方実際染色体上でのG4DNAの形成と解除を行っている因子とそのメカニズムは不明なので、今後もその解析を進める。
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| Strategy for Future Research Activity |
G4DNAがどのように形成され解消さるかを解析するために、G4DNA構造の形成に必要だと考られているDNAを解く機構である転写やDNA複製等に焦点を当てて、研究を計画している。具体的には、G4DNAを形成しえる配列である、I-SceI切断配列を導入したRif1結合配列を制御可能なプロモーター下流に組み込み、薬剤依存的に転写を誘導した時にG4DNAが形成されRif1が結合できるかをChIPやその周辺のDNA複製の状況を解析することにより検証する。一方で、G4DNA構造を解消すると言われるヘリカーゼ因子の過剰発現を誘導した時にG4DNAが解消され、Rif1の結合が解除されるか等を検証する。
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| Causes of Carryover |
G4DNAの細胞内の形成を検出する方法の確立やその手法を論文へ投稿段階まで進捗していることから、年次計画が順調に遂行されたため、研究費の節約になった。次年度へ繰り越された研究費に関しては、現在投稿中の論文の審査員からの指摘に対する回答や改訂のために必要となる実験に掛かる費用に等に使用すること計画している。
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