Cell-free approach to design cellulose nanofibers

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 18K06142
• Research Institution: Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University
• Principal Investigator: 中島 啓介 沖縄科学技術大学院大学, マリンゲノミックスユニット, スタッフサイエンティスト (10422924)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今井 友也 京都大学, 生存圏研究所, 教授 (90509142)
• Project Period (FY): 2018-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: セルロース / セルロース合成酵素 / インビトロ合成 / ホヤ / カタユウレイボヤ

Outline of Annual Research Achievements

カタユウレイボヤ胚から調製した膜タンパク質画分を用いて、C14標識したUDP-グルコースの取り込み活性を液体シンチレーションを用いて評価した。取り込み反応後のセルラーゼ処理の有無で生じる取り込み活性の差分をセルロース合成活性とし、その活性の至適条件（pH・温度・2価金属イオン種および濃度）を求めた。至適条件でのインビトロ合成産物をフーリエ変換赤外分光法および電子線回折に供して、それがセルロースであることを確かめた。しかし、分析結果は、インビトロ合成されたセルロースが想定された平行鎖構造ではなく、逆平行鎖構造であることを示していた。カタユウレイボヤを含め、自然界で合成されたセルロースは平行鎖構造をとることから、本合成系には平行鎖構造をとるために必要な因子が何か欠けていると受け止めた。その因子を探るべく、様々な条件でのインビトロ合成を試み、その産物の分析と検討を行ったが、未だ因子は不明である。そこで、平行鎖合成の試みは今後の主たる課題の１つとして留めおき、急がば回れの精神で、本インビトロ合成系におけるセルロース合成酵素の評価を行った。まず、昨年度明らかにしたリン酸化が起きていることを確認した。ついで、ブルーネイティブ電気泳動法により、セルロース合成酵素がタンパク複合体を形成していること、その分子量が３量体から４量体に相当することを明らかにした。同複合体の構成要素を明らかにすべく、ゲルから抽出したタンパク質を液体クロマトグラフィータンデム質量分析に供して分析中である。このように、昨年までに確立させた独自の技術系を活用して、新たな課題を設定しつつ、着実にカタユウレイボヤのセルロース生合成機構について理解を深められた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究期間中に確立させた実験系（ホヤ試料からの膜タンパク質精製系・RI取り込み活性評価系）を安定的に運用・活用し、着実に新知見を得るとともに、新たな課題を具体的な問題設定に落とし込み、新技術の導入により、セルロース合成酵素複合体に関する新しい知見が得られているため。

Strategy for Future Research Activity

インビトロ合成系において、天然セルロース同様の平行鎖が合成されない因子を探ることで、生合成ならではの階層構造形成の秘密を明らかにできると考えている。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスによる業務遂行へのネガティブな影響を考慮し、一年間の延長が必要となったため、その予算が生じた。