2019 Fiscal Year Research-status Report
Epigenetic regulation of dedifferentiation-inducible genes mediated by macrophage during regeneration
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18K06184
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
板東 哲哉 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 講師 (60423422)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 再生 / コオロギ / マクロファージ / Toll |
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| Outline of Annual Research Achievements |
フタホシコオロギの後脚を脛節で切断すると、傷口の修復、再生芽の形成、位置情報の認識を経て、再生芽細胞が再パターニングされて失われた部分のみが付加的に再生される。昆虫の体液には白血球系の細胞のみが含まれ、マクロファージに該当する細胞はプラズマ細胞と呼ばれる。クロドロン酸含有リポソームを用いてプラズマ細胞を枯渇させたフタホシコオロギでは、再生芽が形成されず脚再生が阻害された。
RNAiを行って自然免疫に関わるToll-like receptor(TLR)シグナルを機能低下させると、プラズマ細胞を枯渇させた場合と良く似た表現型が観察された。フタホシコオロギのゲノムにはToll受容体をコードする遺伝子が11遺伝子存在する。それぞれの遺伝子を特異的に検出できるプライマーを設計して定量PCRを行ったところ、再生に伴って発現上昇するのは3遺伝子、発現低下するのは4遺伝子であった。発現上昇した3遺伝子は、クロドロン酸リポソーム投与によりプラズマ細胞を枯渇させた場合でも発現が低下したことから、プラズマ細胞に発現するToll受容体をコードしていると考えられた。これら3遺伝子のうち2遺伝子は、RNAiにより高頻度に再生不全を示したため、これらの遺伝子について機能解析を行っている。RNAiの濃度依存性も検討したが、濃度依存性は見られなかった。またTLRシグナルの標的遺伝子の1つである抗菌ペプチド遺伝子をクローニングし、脚再生過程での発現変化を調べたが、再生に伴った発現上昇は観察されなかったことから、感染によるTollシグナルの活性化が再生を制御するわけではないと考えられた。
また、エピジェネティック因子と共役して再生に寄与することが期待される転写因子の探索も行い、初期応答遺伝子、血管形成誘導遺伝子、ヒストンリジン脱メチル化酵素関連遺伝子を候補として機能的スクリーニングを進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
コオロギの脚再生に昆虫マクロファージに該当するプラズマ細胞が必須の機能を果たしていること、プラズマ細胞に発現するToll受容体のうち2遺伝子が脚再生に必要であることを明らかにした。またToll受容体の標的遺伝子である抗菌ペプチド遺伝子の発現が再生に伴って上昇しないことから、プラズマ細胞の働きは感染に対する防御ではないことが示唆された。前年度までに、Tollシグナルの下流ではたらく転写因子NFkBの結合配列が昆虫サイトカインをコードするupd遺伝子の上流領域に散在することを見出している。実際に、コオロギの脚再生過程ではupd遺伝子の発現が上昇して、プラズマ細胞を枯渇させるとupdの発現が低下すること、またupd遺伝子に対するRNAiを行ったコオロギは再生能が低下することも分かっている。今後は、感染以外の刺激によるTollシグナルの活性化や、抗菌ペプチド遺伝子以外の標的遺伝子の発現を制御するエピジェネティックな機構について調べる。
また、当該年度に行った機能的スクリーニングから、初期応答遺伝子や血管形成誘導遺伝子が再生に寄与する可能性が示唆されている。コオロギ以外のモデル動物の研究から、初期応答遺伝子はDNMTやCBP/p300と結合して機能することが知られていることから、初期応答遺伝子と共役するエピジェネティック因子の機能の解析も進めたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
コオロギ脚再生においてプラズマ細胞の機能が必須であり、その機能の一部はいくつかのToll受容体によって担われていることが分かった。またコオロギ脚再生過程におけるToll受容体の標的遺伝子は、感染時に発現上昇する抗菌ペプチド遺伝子ではなく、昆虫サイトカイン遺伝子updと示唆された。抗菌ペプチド遺伝子もupd遺伝子も発現はNFkBに依存していると考えられ、感染時と再生時では共役するエピジェネティック因子に依存して標的遺伝子の発現を切り替えている可能性が示唆される。プラズマ細胞を枯渇させて再生不能にしたコオロギではヒストンH3K9アセチル化が低下することから、再生時にはヒストンアセチル化酵素がNFkBと共役していることが期待される。NFkBと共役するエピジェネティック因子の探索を、比較RNA-seqにより行う。
機能的スクリーニングから、初期応答遺伝がコオロギ脚再生に関連することが分かった。初期応答遺伝子はDNMTやCBP/p300と結合することが知られており、CBPはヒストンアセチル化酵素をコードしている。NFkBと初期応答遺伝子、CBPの機能的な関連についても解析する。
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| Causes of Carryover |
理由：RNA-seqの実施を予定していたが、研究の進展によって感染時と再生時を区別してRNAサンプルを取得する必要が考えられたため、予定を変更して次年度にRNA-seqを行うことになった。またプラズマ細胞を可視化するため、蛍光標識されたマクロファージターゲットリポソームを特注で作製する必要があったため、次年度使用額が生じた。
使用計画：次年度に条件毎にRNAサンプルを抽出してRNA-seqを行う。またマクロファージターゲットリポソームを特注にて作製し、感染時や再生時のプラズマ細胞の挙動を観察するのに使用する。
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