2020 Fiscal Year Research-status Report
ヒメツリガネゴケの幹細胞化における新奇DNA合成の分子機構の解明
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18K06302
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
石川 雅樹 基礎生物学研究所, 生物進化研究部門, 助教 (00586894)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ヒメツリガネゴケ / 幹細胞 / DNA合成 / 細胞周期 / 細胞運命転換 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒメツリガネゴケの切断葉における幹細胞化の過程では、細胞周期S期のDNA複製とは異なった新奇DNA合成がおこる。本研究では、この新奇DNA合成の実体とその生物学的意義を明らかにすることを目的とし、幹細胞化でおこるDNA合成領域の同定を試みてきた。
前年度までに、チミジンアナログであるEdUを取り込ませたゲノムDNAを幹細胞化している細胞から回収し、EdUをビオチン化しストレプトアビジンビーズで回収することで、新奇DNA合成領域の同定を試みてきた。また並行して、NanoPoreシーケンス技術を用いた新奇DNA合成領域を特定する方法の開発も行なってきた。しかしながら、切断葉では幹細胞化が同調的に起こっていなようで、EdUの取り込み量にばらつきが生じるという問題が生じた。一方、全く別のアプローチから、幹細胞化における新奇DNA合成は、DNA修復系の一つである塩基除去修復システムを利用したゲノムDNAの脱メチル化による可能性が示唆された。そこで研究計画を変更し、幹細胞化におけるゲノムDNAの脱メチル化がおこる領域を特定することを目的として、Bisufite-seq解析を開始した。
新奇DNA合成の開始点を同定する目的で、PCNA1-GFPラインを用いたChIP-seq解析、および、遺伝子座ごとのシスエレメントに結合するタンパク質を回収し、 網羅的にタンパク質を同定する方法の開発にも着手する予定であったが、幹細胞化における新奇DNA合成が塩基除去システムを利用したDNA脱メチル化の可能性が示唆されたため、本研究課題の目的に照らし合わせ、幹細胞化における脱メチル化領域を同定する実験に集中した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
EdUを取り込ませたゲノムDNAを回収するための条件検討を行ってきたが、EdUの取り込み量にばらつきが生じるという問題が生じた。一方、新奇DNA合成がDNA修復系を用いたDNA脱メチル化の可能性が示唆されたので、研究計画を変更し、幹細胞化におけるDNA脱メチル化を解析するBisulfite-seq解析を行うことで、幹細胞化における新奇DNA合成の実体解明へ繋がることが期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
新奇DNA合成がDNA修復系を用いたDNA脱メチル化の可能性が示唆されたので、研究計画を変更し、幹細胞化によって誘導されるDNA脱メチル化領域を同定する。
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| Causes of Carryover |
(次年度使用額が生じた理由) 幹細胞化している細胞に均一にEdUを取り込ませることが困難であることが判明し、次世代シーケンスを用いたゲノム解析が困難であることが判明し、当該次年度使用額が生じた。
(使用計画) 幹細胞化におけるDNA脱メチル化領域の解析に必要な試薬および実験器具の購入費に当てる。
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