2018 Fiscal Year Research-status Report
母性遺伝における父方ミトコンドリアDNAの選択的分解に関わる分子メカニズムの解明
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18K06313
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
佐々木 成江 名古屋大学, 理学研究科, 准教授 (20359699)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 母性遺伝 / ミトコンドリア / 父方選択的分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリアの「母性遺伝」は、様々な真核生物に共通に見られる現象である。母性遺伝がおこる一連の過程において、DNAヌクレアーゼによる父方のミトコンドリアDNA（mtDNA）の選択的な分解は母性遺伝の引き金となる非常に重要なステップである。しかし、その分子メカニズムはよくわかっていない。本研究では、大型のミトコンドリア核様体を持ち、高純度なミトコンドリア単離が可能な真正粘菌を用い、mtDNAの選択的分解に関わる分子メカニズムの解明を目指している。これまでに我々は、まず、父方mtDNAの選択的分解の鍵因子となるDNAヌクレアーゼを同定するために、父方mtDNAが消失した接合子から単離したミトコンドリアをLC-MS/MS解析を行い、9種類のDNAヌクレアーゼ候補を同定してきた。今回、接合時期以外の細胞（アメーバ、変形体）からミトコンドリアを単離し、LC-MS/MS解析を行ったところ、それら9種類のDNAヌクレアーゼはアメーバや変形体でも存在し、接合子特異的に存在していないことが明らかになった。よって、父方mtDNAの選択的分解のメカニズムとして、接合後のヌクレアーゼの活性化機構が存在する可能性が示唆された。また、母性遺伝に関わるDNAヌクレアーゼを同定するために、単離ミトコンドリアを用い、semi-in vitroで母性遺伝を再現する系を確立した。その結果、接合子から単離したミトコンドリアでのみ、マグネシウムイオンを添加することで、ミトコンドリア内のDNAが分解されることが分かった。よって、父方mtDNAの選択的分解に関与するヌクレアーゼはマグネシウムイオン要求性である可能性が高い。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
接合子のミトコンドリアに含まれる9種類のDNAヌクレアーゼの中から、父方mtDNAの選択的分解に関わるDNAヌクレアーゼ候補を絞るために、様々な時期の細胞からミトコンドリアを単離し、比較した。すべての細胞において、それらのDNAヌクレアーゼが検出されたため、候補を絞ることが出来なかったが、DNAヌクレアーゼの有無により父方mtDNAの選択的分解が制御されていないことは明らかになった。また、当初の提案にはなかった単離ミトコンドリアを用いたsemi-in vitro系の開発を行った。これまで、単離ミトコンドリアをSDS-PAGEし、DNA入りのゲル内でヌクレアーゼ活性を検出するザイモグラフィー法により、接合前後のミトコンドリア内にカルシウムイオンやマンガンイオン要求性のヌクレアーゼが存在することが示されていた（Moriyama et al. 2005）。今回開発した系は、ザイモグラフィー法よりもin vivoを再現しており、それらの金属イオンでは、ミトコンドリア内のDNAが分解できず、マグネシウムイオンが必要であった。接合子のミトコンドリアに含まれる9種類のDNAヌクレアーゼの中で、マグネシウムイオンを必要とするヌクレアーゼは6種類であり、候補を絞り込むことができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
①接合子のミトコンドリアに含まれる9種類のDNAヌクレアーゼの中で、マグネシウムイオンを必要とするヌクレアーゼは6種類に関して、抗体を作成し接合子における時空間的な挙動の解析を行う。
②真正粘菌におけるCRISPR/Cas9システムを用いた遺伝子破壊法を確立し、母性遺伝を担うDNAヌクレアーゼの特定を行う。
③大腸菌で発現させ精製したタンパク質を用いて、同定されたDNAヌクレアーゼの性状解析を行う。
④マイクロ流体ディバイスを用いて接合子からの父方・母方ミトコンドリア分画法を開発し、比較プロテオミクス解析を用いて、ヌクレアーゼの活性を制御する因子候補の探索を行う。
⑤上記解析で得られた制御因子候補について遺伝子破壊を行い、母性遺伝が破たんするかを解析し、DNAヌクレアーゼが接合後の父方ミトコンドリアのみで働くための制御因子を特定する。
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| Causes of Carryover |
局在解析に必要である抗体の作成が、次年度に持ち越されたため。
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