2018 Fiscal Year Research-status Report
Physiological analysis of the courtship pheromones in both sexes: a study of the molecular mechanism of mate selection in newts.
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18K06321
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| Research Institution | Nippon Veterinary and Life Science University |
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Principal Investigator |
中田 友明 日本獣医生命科学大学, 獣医学部, 講師 (50549566)
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| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 性フェロモン / 性行動 / イモリ / 両生類 / 鋤鼻器 / ホルモン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
繁殖期のアカハライモリの成熟雌は同時期に求愛に際して雄個体の分泌する性フェロモンペプチドソデフリンに誘引されるが、フェロモンの主な受容器官は鋤鼻器であり、そこに局在する感覚細胞は副嗅球へ投射することが先行研究でわかっていた。本年度は①鋤鼻機に存在する多くの需要細胞のうち特異的にソデフリンに応答する受容細胞（ソデフリン受容細胞）の同定と、②フェロモンの一次感覚中枢である副嗅球以降の詳細なフェロモン受容神経回路の同定を目的として研究を実施・継続している。研究開始に当たる当該年度、アカハライモリの性フェロモン受容機構を明らかにするための第一段階として、研究の進捗状況の項に詳細な内容を記したいくつかの実験を行ない、目的を達成する一定の結果を得て、関連する研究成果を所属学会・動物園等で以下の通り、講演・発表を行なった。
[１] ○中田 友明「匂いで惹き合うイモリの性フェロモン」都立動物園・水族園合同企画 身近な水辺保全講演会 第2回 イモリを調べる・イモリを守る. 井の頭自然文化園（東京）. 3月. 2019年.
[２] ○中田 友明、富永 篤、持田 浩治、豊田 ふみよ、菊山 榮「イモリ性フェロモン遺伝子の地域多様性」日本動物学会関東支部 第71回大会. 中央大学（東京）. 3月. 2019年.
[３] ○中田 友明、富永 篤、持田 浩治、豊田 ふみよ、菊山 榮「イモリ性フェロモンの地域多様性」第89回日本動物学会 札幌大会. 北海道大学（北海道）. 9月. 2018年.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究の具体的進捗状況を下記に記す。
[１]agmatineラベルによるソデフリン受容細胞の同定
これまでCa2+ imaging法により、成熟雌イモリの解離鋤鼻細胞中にソデフリン受容細胞が1％前後存在する事が確かめられていたが、その細胞の組織内局在や細胞の詳細な情報は得られていない。本実験ではアルギニンの脱炭酸化物であり、有尾両生類のフェロモン受容細胞の興奮後にカチオンチャンネルを介して興奮神経細胞に取り込まれるアグマチン（agmatine）の取り込みを指標として、雌イモリの嗅覚器官に備わるソデフリン受容応答細胞を可視化することを目的として行なった。
具体的には、成熟雌イモリを行動学的に効果の見られる濃度のソデフリンとアグマチンを含んだ水中に留置し、ソデフリン受容細胞の興奮に伴う受容細胞へのアグマチンの取り込みを行なった上で、嗅覚器官の凍結切片を作成、抗アグマチン抗体によって、ソデフリン応答によってアグマチンを取り込んだ細胞を可視化した。染色の結果、ソデフリン受容細胞とみられる抗アグマチン抗体免疫陽性細胞が、鋤鼻器・嗅上皮に確認された。
[２]target toxinによる性フェロモン受容細胞の破壊実験
受容体との結合に影響を与えないソデフリンのN末端にビオチンを結合させたものと、ストレプトアビジンを付加したサポリンと混合することで、ソデフリン受容体に特異的に結合する神経毒素（ターゲットトキシン）を準備し、このターゲットトキシンで処理した成熟雌イモリがソデフリンに対し行動的応答を消失させることを確認した。この時の雌イモリの嗅覚上皮に発現するmRNAを暴露前のそれとトランスクリプトーム比較解析すると、ソデフリン受容細胞を破壊するターゲットトキシンの暴露後に嗅覚受容体タンパク質数種を含むいくつかの遺伝子が統計的有意にその発現量を減少させていることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度得られた成果をもとに、今後以下のような研究を展開する予定である。
[１]agmatineラベルによるソデフリン受容細胞の解析
組織中に観察されるソデフリン応答時にアグマチンを取り込んだ細胞群の詳細なタイプ分けを行うために、嗅覚受容神経細胞のマーカー分子であるOMP（olfactory marker protein）や、脊椎動物に備わる3つの主要な嗅覚受容体タンパク質ファミリー（匂い受容体(odorant receptors)：ORs; １型鋤鼻受容体(vomeronasal type 1 receptors)：V1Rs; ２型鋤鼻受容体(vomeronasal type 2 receptors)：V2Rs;）のそれぞれと共役する3つGタンパク質αサブユニット(Gαolf；Gαi2；Gαo)などとの二重免疫染色を行う方策である。さらに、ソデフリンは未成熟や非繁殖期の雌や雄において行動学的・細胞生理学的に応答を引き起こさないことが、嗜好性試験・Ca2+ imaging法によって明らかになっているため、成熟段階や個体の内分泌的条件に応じてソデフリン応答を引き起こす状態とそうでない状態とで、組織学的にフェロモン受容細胞やその周辺組織が如何なる変貌をみせるのかを随時明らかにしていく予定である。
[２]target toxinによる性フェロモン受容細胞破壊モデルでのフェロモン神経系の同定
トランスクリプトーム解析によって、ターゲットトキシンへの暴露によって発現変動のみられた遺伝子のクローニングや局在の解析、嗅覚受容体タンパク質のソデフリンとの結合性の検証などを随時行う予定である。さらに、脳内の高次中枢に伝達される神経刺激を脳内の神経活動マーカー（pERKなど）を用いて同様にターゲットトキシンへの暴露の有無や性・個体の内分泌学的状態ごとに精査していく予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度は、次世代シーケンサーを用いた高額解析が年度内で終わらず次年度の決済となったこと、②所属学会の大会事務局を行なったため旅費を当研究費から捻出する必要がなくなったことの2点より次年度使用額が生じた。
上記の①に関しては、研究の進捗でもその内容を期した通り2019年4月現在ですでに実行されており、当該年度繰越分より支払いの予定である。上記②に関しては、次年度以降の研究における動物捕獲活動や学会発表等をより活発に行い、実験成果の充実と成果発表の機会増加にあてる予定である。
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