2018 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
18K06350
|
|---|
| Research Institution | Okayama University |
|---|
Principal Investigator |
阿保 達彦 岡山大学, 自然科学研究科, 准教授 (90303601)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2018-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | リボソームレスキュー / バクテリア / オルガネラ / 翻訳 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
大腸菌のリボソームレスキュー因子ArfBはクラスI翻訳終結因子RF1・RF2のホモログであり，終止コドンを持たないmRNAの3'末端で立ち往生したリボソームにRFとして作用し，レスキューする。ArfBのリボソームレスキュー機能の発揮には，ArfBとRFに共通して見られ，RFによるペプチジルtRNAの加水分解に関与する，いわゆるグリシン-グリシン-グルタミン（GGQ）モチーフ，およびArfBにのみ存在し，リボソームとの結合に必要とされる塩基性アミノ酸残基に富んだC末端尾部が必須である。シロイヌナズナゲノムにコードされるArfBのホモログ，AtArfBは大腸菌翻訳系を利用したアッセイ系でリボソームレスキュー活性を示すが，上記GGQモチーフ，C末端尾部にアミノ酸変異や欠失変異を導入したところ，その活性が著しく減少した。これはAtArfBがArfBと同様の機構でリボソームをレスキューすることを強く示唆する。
AtArfBが葉緑体移行シグナルと思われる配列をN末端に持つことから葉緑体で機能する因子であることは予想された。そこで，AtArfBの葉緑体移行シグナルと思われる配列にGFPを融合させた人工タンパク質をタバコ細胞内で発現させたところ，葉緑体に局在することが示された。AtArfBの全長にGFPを融合させた時も同様の結果が得られ，実際にAtArfBが葉緑体で機能する因子であることが強く示唆された。
AtArfB欠失植物体を構築した。得られた変異体について，強光，貧栄養など様々な条件で発芽，生育させ，その表原型を解析したが，これまでのところ明確な表現型を見出すには至っていない。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
大腸菌をはじめとするバクテリアは，リボソームレスキュー機構が生育に必須である。これは我々が大腸菌において明確に示した概念である。バクテリアの翻訳系に似た翻訳システムを持つ葉緑体，ミトコンドリアなどのオルガネラにおいても，リボソームレスキューの重要性は同様であると予想され，実際，ヒトミトコンドリアで機能するArfBホモログ，ICT1はヒトの細胞におけるミトコンドリアの維持，引いてヒト細胞の生育に必須である。ところが作成したAtArfB欠損植物体を様々な条件で解析しても，これまで明確な表現型が見られていない。その原因として，1）シロイヌナズナ葉緑体ではリボソームレスキューは必須ではない，2）シロイヌナズナ葉緑体には複数のリボソームレスキュー因子が存在する，3）アッセイ系に不備があり表原型を見出すに至っていない，の3つが考えられた。その中でも特に3）の検証に時間を取られ，研究の進捗に遅れが生じた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
AtArfB欠損植物体に明確な表現型が見られていない原因として考えられた1）シロイヌナズナ葉緑体ではリボソームレスキューは必須ではない，2）シロイヌナズナ葉緑体には複数のリボソームレスキュー因子が存在する，3）アッセイ系に不備があり表原型を見出すに至っていない，の3つのうち，2）に着目して検証を行う。シロイヌナズナゲノムからあらためてRFホモログをスクリーンし，AtArfBとの二重変異を作成し，その表現型を解析する。また，ゼニゴケで見出したMpArfBに関しても同様の解析を進める。さらに，AtArfBの構造をX戦結晶構造解析などの手法で明らかにし，葉緑体におけるリボソームレスキューの生理学的意義と重要性について多角的に解析する。さらに当初の計画通りAtArfB，MpArfBとリボソームとの相互作用を解析するなど，生化学的解析を進め，葉緑体におけるリボソームレスキューの全体像の理解を目指す。
|
| Causes of Carryover |
研究計画通りに進捗した場合に実施予定であった各種解析を行えなかったことから，特に試薬，酵素などの使用量が当初計画より少なくなり，結果として余剰が生じた。
余剰分は令和元年度に実施する研究にて使用予定である。
|
Research Products
(2 results)
